一种海洋致病菌的可视化检测组合物及其应用和检测方法技术

本申请涉及生物技术领域，公开了一种海洋致病菌的可视化检测组合物及其应用和检测方法。本申请以副溶血性弧菌核酸适配体为识别分子，与HCR反应引发链I链杂交，构建核酸适配体探针。当副溶血弧菌存在时，其将与核酸适配体探针特异性结合，HCR反应引发链I链得以脱离并诱导H1和H2探针交替打开形成一条长双链共聚物，同时形成大量G

【技术实现步骤摘要】
一种海洋致病菌的可视化检测组合物及其应用和检测方法


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及一种海洋致病菌的可视化检测组合物及其应用和检测方法。

技术介绍

[0002]副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)为革兰氏阴性菌，嗜盐不耐酸，天然存在于沿海、河口等海洋环境中，常见于鱼、虾、贝类，是水产养殖中最常见的致病菌之一，给海水养殖业造成巨大经济损失的同时也严重威胁着人类健康。副溶血弧菌主要感染途径为食用生的或未煮熟的水产品，临床上可引起典型的肠胃炎反应，如腹痛、呕吐、腹泻及水样便等。随着全球变暖，不断升高的海洋温度直接导致弧菌进一步扩散，副溶血性弧菌已成为全球海鲜食物中毒的主要原因。食品中副溶血性弧菌的常规检测通常采用一系列基于培养基的形态学和生化表征方法，这些传统检测方法国标法耗时费力，准确度低，难以满足快速鉴定的需要。现有快速检测方法如免疫学检测方法以及分子生物学检测方法等都有相应的问题存在，如程序复杂、稳定性差、易出现假阳性假阴性、只能定性无法定量检测等。因此，因此有必要建立能克服以上缺点的、快速简便的副溶血性弧菌检测新方法。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本申请的目的在于提供一种海洋致病菌的可视化检测组合物，使其应用于副溶血弧菌的检测中实现可视化定性定量检测，并具有较佳的灵敏度和特异性，同时方便快捷。
[0004]为了解决上述技术问题/达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题/达到上述目的，作为本申请的第一个方面，提供了一种海洋致病菌的可视化检测组合物，包括副溶血性弧菌核酸适配体、HCR反应引发链I链、发卡探针H1和发卡探针H2；其中，所述副溶血性弧菌核酸适配体为序列如SEQ ID No.1所示的单链核苷酸，所述HCR反应引发链I链为序列如SEQ ID No.2所示的单链核苷酸，所述发卡探针H1为如SEQ ID No.3所示的单链核苷酸，所述发卡探针H2为序列如SEQ ID No.4所示的单链核苷酸。
[0005]可选地，所述副溶血性弧菌核酸适配体标记有生物素或链霉亲和素。
[0006]可选地，还包括显色试剂；其中，所述显色试剂包括Cu
2+
、TMB和双氧水，或者包括氯化血红素、ABTS和双氧水，或者包括氯化血红素、TMB和双氧水。
[0007]作为本申请的第二个方面，提供了所述检测组合物在非诊断目的检测副溶血弧菌中的应用或在制备检测副溶血弧菌的试剂盒中的应用。
[0008]作为本申请的第三个方面，提供了一种检测副溶血弧菌的试剂盒，包括本申请所述检测组合物，以及选自缓冲液、DEPC水、链霉亲和素或生物素标记的磁珠、磁铁中的一种或两种以上。
[0009]作为本申请的第四个方面，提供了一种非诊断目的检测副溶血弧菌的方法，包括：
[0010]获得待测样品；
[0011]将生物素或链霉亲和素标记的副溶血性弧菌核酸适配体与HCR反应引发链I链杂交形成核酸适配体探针，用链霉亲和素或生物素标记的磁珠富集所述核酸适配体探针，形成复合物；
[0012]所述待测样品与所述复合物孵育，孵育后取上清液，然后加入发卡探针H1和发卡探针H2继续孵育；
[0013]孵育完成后加入显色试剂反应，根据颜色直观定性判断是否存在副溶血性弧菌。
[0014]可选地，还包括制备副溶血性弧菌浓度
‑
吸光度值的标准曲线进行定量检测：
[0015]配制一系列已知浓度的副溶血性弧菌菌液，参照本申请所述方法进行检测，并使用酶标仪记录不同浓度菌液反应后的380nm
‑
500nm的吸收光谱，以副溶血性弧菌浓度及其对应的吸光度值为坐标，得到吸光度值随副溶血性弧菌浓度变化的曲线；
[0016]在曲线上找到具有线性变化规律的点，进行线性拟合，获得副溶血性弧菌浓度
‑
吸光度值的标准曲线；
[0017]将待测样品检测后获得的吸光度值代入到标准曲线中获得定量检测结果。
[0018]可选地，还包括制备副溶血性弧菌浓度
‑
色度值的标准比色卡进行半定量检测：
[0019]配制一系列已知浓度的副溶血性弧菌菌液，参照本申请所述方法进行检测，记录不同副溶血性弧菌浓度及其对应的色度值，并制作出标准比色卡；
[0020]将待测样品检测后，根据其呈现的颜色与所制备的标准比色卡比对，获得半定量检测结果。
[0021]可选地，获得待测样品的方式包括：
[0022]取水产品脏器组织于研钵中，加入无菌生理盐水充分研磨后静置，离心得到水产品样本上清液。
[0023]本申请以副溶血性弧菌核酸适配体为识别分子，与HCR反应引发链I链杂交，构建核酸适配体探针。当副溶血弧菌存在时，其将与核酸适配体探针特异性结合，HCR反应引发链I链得以脱离并诱导两条可杂交互补并带有粘性末端的发夹型DNA(H1和H2探针)交替打开形成一条长双链共聚物，同时形成大量G
‑
四链体结构，实现信号放大。加入显色体系后，形成具有过氧化物酶活性的DNAzymes，催化H2O2氧化底物ABTS/TMB并显色。本申请基于检测组合物的检测方法简便易行，具有高稳定性、高灵敏度和特异性，可实现对副溶血性弧菌的定性定量可视化检测，对海水养殖动物病原微生物感染性疾病早期预警防控具有重要的现实指导意义。
附图说明
[0024]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定；
[0025]图1所示为本申请所述方法的检测原理示意图；Ap表示核酸适配体，I表示HCR反应引发链I1，V.P表示副溶血性弧菌，Hemin表示氯化血红素；
[0026]图2所示为吸收光谱及凝胶电泳验证本申请副溶血性弧菌可视化检测方法的可行性结果；V.P表示副溶血性弧菌，Ap/I1为核酸适配体探针；
[0027]图3所示为本申请副溶血性弧菌可视化检测方法的特异性结果；(a)对照组；(b)副溶血性弧菌；(c)金黄色葡萄球菌；(d)铜绿假单胞菌；(E)阴沟肠杆菌；(f)克雷伯菌；(g)粪
肠球菌；(h)奇异变形菌；
[0028]图4所示为本申请副溶血性弧菌可视化检测方法的灵敏度检测结果；图例中副溶血性弧菌浓度单位为CFU/mL；
[0029]图5所示为本申请副溶血性弧菌可视化检测方法的拟合曲线；
[0030]图6
‑
图9所示为对比例1
‑
对比例4的检测组合物凝胶电泳验证结果；
[0031]图10所示为石斑鱼养殖注入的外海水以及不同池水的副溶血性弧菌实例检测结果；a，溶血副弧菌；b，对照组；c，池水1；d，池水2；e，池水3；f，池水4；g，池水5；h，池水6；i，外海水；
[0032]图11所示为石斑鱼不同组织部位副溶血性弧菌实例检测结果；横坐标依次为副溶血性弧菌、对照组、心脏、肝脏、肾脏、胰腺、肠、鳃、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海洋致病菌的可视化检测组合物，其特征在于，包括副溶血性弧菌核酸适配体、HCR反应引发链I链、发卡探针H1和发卡探针H2；其中，所述副溶血性弧菌核酸适配体为序列如SEQ ID No.1所示的单链核苷酸，所述HCR反应引发链I链为序列如SEQ ID No.2所示的单链核苷酸，所述发卡探针H1为如SEQ ID No.3所示的单链核苷酸，所述发卡探针H2为序列如SEQ ID No.4所示的单链核苷酸。2.根据权利要求1所述的检测组合物，其特征在于，所述副溶血性弧菌核酸适配体标记有生物素或链霉亲和素。3.根据权利要求1或2所述的检测组合物，其特征在于，还包括显色试剂。4.根据权利要求3所述的检测组合物，其特征在于，所述显色试剂包括Cu
2+
、TMB和双氧水，或者包括氯化血红素、ABTS和双氧水，或者包括氯化血红素、TMB和双氧水。5.权利要求1
‑
4任意一项所述检测组合物在非诊断目的检测副溶血弧菌中的应用或在制备检测副溶血弧菌的试剂盒中的应用。6.一种检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
‑
4任意一项所述检测组合物，以及选自缓冲液、DEPC水、磁珠、磁铁中的一种或两种以上。7.一种非诊断目的检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括：获得待测样品；将生物素或链霉亲和素标记的副溶血性弧菌核酸适配体与HCR反应引发链I链杂交形成核酸适配体探针，用链霉亲和素或生物素标记的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾姝，王佳丽，万逸，韩诗雅，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：