一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR-Cas9检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR
‑
Cas9检测方法及应用


[0001]本专利技术属于分子诊断和基因诊断领域，为体外诊断试剂，检测对象为导致利福平或异烟肼耐药结核分枝杆菌的基因突变，是一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR
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Cas9 检测方法及应用，具体是利用PCR技术将PAM序列引入至耐药突变位点附近并用于检测rpoB基因耐药突变位点检测的CRISPR
‑
Cas9方法及应用。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌感染导致的结核病（结核）是不可忽视的全球公共卫生问题，根据WHO数据，2021年新发结核患者共计1060万，导致了160万人死亡，其中约有4.4%结核分枝杆菌对异烟肼与利福平不敏感，并最终导致了29%的结核死亡病例。因此，结核分枝杆菌耐药为结核病的治疗造成了极大挑战。
[0003]细菌培养的菌株鉴定和药敏试验是结核分枝杆菌和耐药结核分枝杆菌的金标准，然而由于结核是一种缓慢生长细菌，培养时间往往长达8周，药敏试验则耗时更长，无法准确指导临床用药。目前的商用结核耐药检测试剂盒GeneXpert
®ꢀ
（USA）虽然提高了特异性，但是昂贵的试剂耗材价格与专用仪器价格使其难以在基层医院推广。且其检测的耐药位点仅两个，对结核菌耐药位点的覆盖不足。
[0004]结核分枝杆菌的RNA聚合酶β亚单位（rpoB）基因507密码子至533密码子的81bp核心区域极大程度地决定了结核分枝杆菌是否存在利福平耐药。rpoB基因突变导是导致利福平耐药的主要机制，并且多个位点的突变均能导致利福平耐药现象的出现。目前临床上超过95%的利福平耐药结核分枝杆菌存在rpoB核心区域突变。前期的病例采样与测序结果显示，90%以上的rpoB突变位点发生在531位点、526位点和516位点。然而531位点、526位点和516位点附近均不存在天然PAM序列，无法直接使用CRISPR
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Cas9体系进行耐药基因突变检测。
[0005]因此，如果在任意位点附近人工引入PAM序列则可以极大地增大CRISPR
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Cas9耐药基因突变检测体系的应用范围，使结核分枝杆菌任意位点均可以利用CRISPR
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Cas9体系进行耐药突变的检测。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR
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Cas9 检测方法及应用，具体为用于结核分枝杆菌耐药基因高效扩增与指定位置插入PAM序列的巢式PCR引物组，以及用于结核分枝杆菌常见耐药基因，例如rpoB耐药基因突变检测的CRISPR
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Cas9体系及其应用，本专利技术所采取的技术方案如下：一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR
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Cas9 检测方法，包括巢式PCR引物组，所述巢式PCR引物组为用于结核分枝杆菌rpoB基因531/526/516突变位点附近PAM序
列插入的引物组，其中，所述引物组序列为：TB
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1F:CCGACGACATCGACCACTT（如SEQIDNO1所示），TB
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1R:GGTACGGCGTTTCGATGAAC（如SEQIDNO2所示），TB
‑
2F:ACGTGGAGGCGATCACA（如SEQIDNO3所示），TB
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531R
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PAM:ACCGCCGGGCCCCAGCCCT（如SEQIDNO4所示），TB
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526R
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PAM:CGCCGACAGTCGGCGCCCG（如SEQIDNO5所示），TB
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516R
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PAM:CGACAGCGGGTTGTTCCCG（如SEQIDNO6所示），本rpoB基因耐药突变位点检测体系还包括sgRNA，其序列为：531R
‑
sgRNA:GGCCACAAGCGCCGACUGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（如SEQIDNO7所示），526R
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sgRNA:GGGCUGUCGGGGUUGACCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（如SEQIDNO8所示），516R
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sgRNA:GGGCUGAGCCAAUUCAUGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（如SEQIDNO9所示），上述rpoB基因耐药位点检测体系应用步骤为：S1.待检样本DNA的提取；S2.按照以下配方配置反应液：预扩增PCR反应组分如下表所示：10μMTB
‑
1F0.1
‑
1.0μmol，10μMTB
‑
1R0.1
‑
1.0μmol，MgCl21.5
‑
6mmol，dNTP0.5
‑
0.25mmol，taq酶1.5
‑
3U，模板1
‑
5ul，H2O补足至25ul；S3.随后进行预扩增PCR反应，具体为：预变性95℃60秒，扩增循环步骤
①
95℃20秒，扩增循环步骤
②
55℃20秒，扩增循环步骤
③
72℃20秒，扩增循环步骤
①
、
②
、
③
循环35次，终延伸72℃120秒；S4.预扩增反应完成后，进行终扩增反应，终扩增反应条件如下：10μMTB
‑
2F0.1
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1.0μmol，10μMTB
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531R
‑
PAM/TB
‑
526R
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PAM/TB
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516R
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PAM0.1
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1.0μmol，MgCl21.5
‑
6mmol，dNTP0.5
‑
0.25mmol，taq酶1.5
‑
3U，
预扩增产物1ul，H2O补足至25ul；S5.随后进行终扩增PCR反应：预变性95℃60秒，扩增循环步骤
①
95℃20秒，扩增循环步骤
②
55℃20秒，扩增循环步骤
③
72℃20秒，扩增循环步骤
①
、
②
、
③
循环35次，终延伸72℃120秒；S6.随后进行sg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR
‑
Cas9检测方法，其特征在于：包括巢式PCR引物组，具体为用于极低丰度结核分枝杆菌rpoB耐药基因高效扩增的巢式PCR引物组、用于在rpoB耐药基因指定位置插入PAM序列的巢式PCR引物组，其序列为：TB
‑
1F:如SEQIDNO1所示，TB
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1R:如SEQIDNO2所示；TB
‑
2F:如SEQIDNO3所示，TB
‑
531R
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PAM:如SEQIDNO4所示，或TB
‑
526R
‑
PAM:如SEQIDNO5所示，或TB
‑
516R
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PAM:如SEQIDNO6所示。2.根据权利要求1所述的用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR
‑
Cas9检测方法，其特征在于，还包括sgRNA，其序列为：531R
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sgRNA:如SEQIDNO7所示，或526R
‑
sgRNA:如SEQIDNO8所示，或516R
‑
sgRNA:如SEQIDNO9所示。3.权利要求1或2所述的CRISPR
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Cas9检测方法在CRISPR
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Cas9试剂盒中的应用。4.权利要求2所述的CRISPR
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Cas9检测方法的非疾病诊断和治疗目的的应用步骤为：S1.待检样本DNA的提取；S2.按照以下配方配置反应液，预扩增PCR反应组分如下表所示：10μMTB
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1F0.1
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1.0μmol；10μMTB
‑
1R0.1
‑
1.0μmol；MgCl21.5
‑
6mmol；dNTP0.5
‑
0.25mmol；taq酶1.5
‑
3U；模板1
‑
5ul；H2O补足至25ul；S3.随后进行预扩增PCR反应；预变性95℃60秒，扩增循环步骤
①
95℃20秒，扩增循环步骤
②
55℃20秒，扩增循环步骤
③
72℃20秒，扩增循环步骤
①
、
②
、
③
循环35次，终延伸72℃120秒；S4.预扩增反应完成后，进行终扩增反应，终扩增反应条件如下：10μMTB
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2F0.1
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1.0μmol，10μMTB
‑
531R
‑
PAM/TB
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526R
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PAM...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓颖，郑瑞轩，张乐翔，叶方富，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：