一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组及其试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组及其试剂盒，属于结核分枝杆菌检测技术领域。本发明专利技术根据结核分枝杆菌所共有的特异基因序列Ag85B设计引物组，包括外引物对F3、B3；内引物对FIP、BIP；环引物对LF、LB，保证了从种的水平上检测不同来源的结核分枝杆菌的可靠性。本发明专利技术利用浊度法实时监测扩增全过程中产生的副产物焦磷酸镁，实现扩增全过程监控。相比较其它方法如PCR，利用本发明专利技术的试剂盒进行检测的方法简单，大大提高了性价比节约了成本；本发明专利技术的试剂盒基于浊度法进行环介导等温扩增具有检测效率高、成本低，准确度高，且能有效减少交叉污染，反应特异性良好，对其他病原菌无扩增条带等优点。原菌无扩增条带等优点。原菌无扩增条带等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及结核分枝杆菌检测
，尤其涉及一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组及其试剂盒。

技术介绍

[0002]结核病(Tμbercμlosis，TB)是一种MTB引发的严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，也是由单一传染因子导致死亡的最常见原因。全球约有1000万人患结核病，约150万人在TB后死亡，约1/3人群患有MTB潜伏感染。
[0003]目前，TB的检测方法主要包括：(1)传统的结核病检测方法，如痰涂片、胸部X线摄影、培养法等已经广泛应用于临床TB诊断。但是这些方法具有检出率及灵敏度低、通量不高、检测周期太长或对免疫缺陷和HIV患者特异性低等不足。再如细菌学诊断有抗酸检色、金胺O荧光染色及结核杆菌培养法等。抗酸检色其优点为操作简便；缺点是阳性率低，灵敏度低；仅为50％～60％。金胺O荧光染色其优点为与暗色背景对比明显，不易漏检。但其缺点是涂片后保存时间过短。(2)免疫学检测，通过定量分析致敏T细胞增殖释放的IFN
‑
γ含量，可诊断有无结核感染。基于免疫反应的血液测试(如结核菌素皮肤试验，γ
‑
干扰素释放试验)也被广泛用于TB诊断潜伏感染者。但在结核菌素皮肤试验中接种过芽孢杆菌的患者会出现假阳性结果，同样可能对艾滋病毒/艾滋病等免疫缺陷患者的反应都不准确。但是对于HIV并合MTB的患者，干扰素释放试验仍然存在敏感度低的问题，或者免疫功能不完全的儿童TB患者中仍然存在这个问题。(3)聚合酶链式反应(PCR)。依据DNA碱基互补原则而设计的一种体外核酸扩增方法；具有敏感性和特异性高，且操作简单等特点。但PCR检测技术所需仪器昂贵，检测成本高，实验室条件要求高，不利于基层实验室的快速检测。(4)环介导等温扩增技术。LAMP技术不需要DNA的变性、退火及循环变温过程，仅需要在恒温条件即可完成扩增。扩增反应所需时间短，约几十分钟。加入环引物可以提高反应效率。且反应具有高水平的灵敏度，同时扩增效率高。LAMP技术阳性扩增反应中会产生焦磷酸镁沉淀与类似花椰菜结构的产物，可以肉眼观察白色沉淀，也可对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察条带。或者通过浊度仪对产物浑浊程度进行实时检测分析。
[0004]现价段结核病临床诊断方向致力于对临床表现、免疫学检测及影像学检查进行综合性分析，但该方法较为复杂，检测的时间长。因此，急需一种检测效率高、特异性好、方法简单的结核分枝杆菌检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组及其试剂盒。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组，包括外引物对、内引物对和环引物对；
[0008]优选的，所述外引物对包括F3、B3，所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所
示；外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0009]优选的，所述内引物对包括FIP、BIP，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0010]优选的，所述环引物对包括LF、LB，所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0011]优选的，所述外引物对、内引物对和环引物对在反应体系中的体积比为2～3:8～12:4～6。
[0012]本专利技术还提供了一种用于检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括所述LAMP引物组和反应液。
[0013]优选的，所述反应液包括2倍浓缩的反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和DNA模板。
[0014]优选的，所述2倍浓缩的反应缓冲液2.5μl的10倍浓缩的isothermal amplification bufferat、2.5μl
‑
5.5μl的10mmol/L dNTPs、0.5μl
‑
3.5μl的100mmol/LMg
+
和4μl
‑
10μl的5mol/LBetiane。
[0015]本专利技术根据结核分枝杆菌所共有的特异基因序列Ag85B设计引物组，包括外引物对F3、B3；内引物对FIP、BIP；环引物对LF、LB。保证了从种的水平上检测不同来源的结核分枝杆菌的可靠性。利用浊度法实时监测扩增全过程中产生的副产物焦磷酸镁，实现扩增全过程监控。相比较其它方法如PCR，利用本专利技术的试剂盒进行检测的方法仅需要简单的设备——浊度仪、离心机和电泳仪即可，大大提高了性价比节约了成本；本专利技术的试剂盒进行基于浊度法环介导等温扩增具有检测效率高、成本低，准确度高，且能有效减少交叉污染、反应特异性良好、对其他病原菌无扩增条带等优点。
附图说明
[0016]图1为实施例1环介导等温扩增产物离心后检测样品目测沉淀结果；
[0017]图2为实施例2不同温度下LAMP浊度法检测的出峰时间；
[0018]图3为实施例2不同温度下LAMP浊度法扩增结果的电泳图；1为63℃，2为64℃，3为65℃，4为66℃，5为Negative；
[0019]图4为实施例2不同体积镁离子溶液的LAMP浊度法检测的出峰时间；
[0020]图5为实施例2不同体积镁离子溶液LAMP浊度法扩增结果的电泳图；1为0.5μL，2为1.5μL，3为2.5μL，4为3.5μL，5为Negative；
[0021]图6为实施例2不同体积dNTPs溶液的LAMP浊度法检测的出峰时间；
[0022]图7为实施例2不同体积dNTPs溶液LAMP浊度法扩增结果的电泳图；1为1.5μL，2为2.5μL，3为3.5μL，4为4.5μL，5为Negative；
[0023]图8为实施例2不同体积Betiane溶液的LAMP浊度法检测的出峰时间；
[0024]图9为实施例2不同体积Betiane溶液LAMP浊度法扩增结果的电泳图；1为4μL，2为6μL，3为8μL，4为10μL，5为Negative；
[0025]图10为实施例3结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌、无菌水的LAMP浊度法扩增结果；
[0026]图11为实施例3结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌、无菌水的LAMP浊度法扩增结果的电泳图；
[0027]图12为实施例4不同DNA浓度LAMP浊度法的检测效果；
[0028]图13为实施例4LAMP浊度法检测中DNA模板浓度对数值与出峰时间的关系。
具体实施方式
[0029]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0030]实施例1
[0031]根据GenBank公布的结核分枝杆菌的Ag85B基因序列(GenBank NC_000962.3)，设计引物，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括外引物对、内引物对和环引物对；所述外引物对包括F3、B3，所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述内引物对包括FIP、BIP，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述环引物对包括LF、LB，所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。2.如权利要求1所述LAMP引物组，其特征在于，所述外引物对、内引物对和环引物对在反应体系中的体积比为2～3:8～12:4～6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈柱，李松，罗高鸣，郭媛，邓燕，周文韬，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：