一种多重实时荧光PCR的引物探针组、检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体公开了一种多重实时荧光PCR的引物探针组、检测方法及应用。本发明专利技术公开了牛腹泻病三种病原基因序列的特异性位点，并针对相应位点实现这三类病原的定性检测。本发明专利技术提供的多重实时荧光PCR的引物探针组能够同时检测引起牛腹泻病的三类主要病原，且具有特异型好、灵敏度高、可同时检测的优点，在牛腹泻病的诊断、治疗、预防中的应用具有重要意义；且本发明专利技术公开的操作方法简便快捷、检测成本较低，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
ID No.2、SEQ ID No.3所示；
[0012](2)用于牛病毒性腹泻病毒检测的上下游引物及探针，其序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；
[0013](3)用于牛隐孢子虫检测的上下游引物及探针，其序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示。
[0014]以上技术方案达到的技术效果是：本专利技术针对三类主要的牛腹泻病病原的基因保守序列设计了三套特异性引物及探针，用于多重荧光PCR反应。一次反应可检索多种病原，实验过程对引物及探针组要求极高，单对引物的扩增效率、多对引物间的扩增影响、各引物与非靶标序列间的错配等问题都需要考虑在内，本专利技术中公开的引物探针组合是在筛选尝试了大量引物组合后得到的最佳反配组合，经实验证实，本专利技术筛选出的引物探针组合扩增效率高、特异性强、灵敏度高。
[0015]多重实时荧光PCR的引物探针组在制备检测牛腹泻病病原体的试剂盒中的应用，其中，所述牛腹泻病病原体包括大肠杆菌O
157
、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。
[0016]本专利技术的引物探针组制备出的试剂盒具有能同时检测三种主要牛腹泻病病原的优点，并且特异性强，灵敏度高。
[0017]一种多重实时荧光PCR检测体系，进一步地，包含如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.9序列所示的引物探针组。
[0018]进一步地，多重实时荧光PCR检测体系还包括多重荧光PCR检测试剂；
[0019]进一步地，所述PCR检测试剂包括荧光PCR反应缓冲液、反应酶、RNase free H2O。
[0020]一种多重实时荧光PCR检测体系的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0021]在进行多重荧光PCR反应时，每种引物浓度为0.8μM，探针终浓度为0.4μM；
[0022]PCR反应条件为：50℃10min逆转录，95℃30s预变性后，95℃10s
→
60℃30s荧光检测，40个循环，选取FAM、HEX、CY5三通道检测。
[0023]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术至少包括如下优点：
[0024]1)本专利技术公开提供了一种多重实时荧光PCR的引物探针组、检测方法及应用，通过对引物及探针进行筛选，得到了一种灵敏度高、特异型强的引物及探针组，检测方法效率高，可同时实现对三类牛腹泻病原单一感染或混合感染的检测，且方法稳定性好。
[0025]2)本专利技术优化的多重荧光定量体系，不同靶标扩增效率相近，抗干扰能力较强，且简单省力。
[0026]3)本专利技术提供的检测方法为三类主要的牛腹泻病病原的检测和净化提供了技术支撑，对人兽共患病原隐孢子虫的检测和降低其潜在的公共卫生风险具有重要意义，填补了荧光PCR检测多类牛腹泻病病原技术的空白。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实时例或现有技术中的技术方案，下面将对实时例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0028]图1附图为实施例2中多重荧光PCR检测体系中，引物和探针浓度优化的扩增图；
[0029]图2附图为实施例2中多重荧光PCR反应退火温度为58℃的扩增图；A、B、C分别对应大肠杆菌O
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、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。
[0030]图3附图为实施例2中多重荧光PCR反应退火温度为59℃的扩增图；A、B、C分别对应大肠杆菌O
157
、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。
[0031]图4附图为实施例2中多重荧光PCR反应退火温度为60℃的扩增图；A、B、C分别对应大肠杆菌O
157
、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。
[0032]图5附图为实施例2中多重荧光PCR反应退火温度为61℃的扩增图；A、B、C分别对应大肠杆菌O
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、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。
[0033]图6附图为实施例2中多重荧光PCR反应退火温度为62℃的扩增图；A、B、C分别对应大肠杆菌O
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、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。
[0034]图7附图为实施例中多重荧光PCR反应特异性检测扩增图；A、B、C分别对应大肠杆菌O
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、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。
[0035]图8附图为普通PCR样本检测凝胶电泳图，A、B、C分别对应大肠杆菌O
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、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫的样本检测。A中1
‑
3号为阳性样本，扩增片段大小为895bp；B中1
‑
2号为阳性样本，扩增片段大小为318bp；C中1
‑
4号为阳性样本，扩增片段大小为643bp。
[0036]图9附图为多重荧光PCR反应灵敏度试验扩增图。
具体实施方式
[0037]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0038]本专利技术中所用到的仪器、试剂与耗材如下所示：
[0039]试剂与耗材：
[0040]HiScript IIOne Step qRT
‑
PCR Probe Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；RNase
‑
free H2O购自韩国Walgene公司；50
×
TAE购自韩国BIONEER公司；GelRed购自美国biotium公司；Real Time PCR 384孔板购自德国Roche公司；10μl/200μl/1000μl吸头购自美国AXYGEN公司；1.5ml/0.5ml离心管购自美国AXYGEN公司；
[0041]仪器设备：
[0042]2720型PCR仪购自美国ABI公司；system electrophoresis Mupid(Mupid2plus)电泳槽购自日本TAKARA公司；image system(EUV
‑
LDUV)凝胶成像系统购自韩国KoreaBiotech公司；centrifuge(MICRO 17TR)离心机购自韩国Hanil公司；超净工作台购自苏州净化公司；2.5μl/10μl/100μl/200μl/1000μl移液器购自德国Eppendorf公司；EppendorfepMotion 5070自动加样工作站购自德国Eppendorf公司；autoclave(LS
‑
B50L)灭菌器购自中国江阴滨江公司；Freez本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重实时荧光PCR的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组能同时检测大肠杆菌O
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、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫，引物及探针的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示。2.权利要求1所述的多重实时荧光PCR的引物探针组在制备检测牛腹泻病病原体的试剂盒中的应用，其中，所述牛腹泻病病原体包括大肠杆菌O
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、牛病毒性腹泻病毒和牛隐孢子虫。3.一种多重实时荧光PCR检测体系，其特征在于，包含权利要求1中所述的引物探针组。4.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秋悦，郑百芹，王磊，潘素敏，孙通宝，吴晨雨，张雪晴，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：