减毒铜绿假单胞菌工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及减毒铜绿假单胞菌工程菌及其构建方法和应用，通过敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT基因，以及pilA、fliC、algD、phzA2G2、qscR中的1个或多个基因，获取所述工程菌。本发明专利技术通过在铜绿假单胞菌中抑制psl、pilA、fliC、algD、phzA1G1、phzA2G2、mexT、qscR基因的表达，构建了多个不同敲除组合重组菌，重组菌与作为出发菌株的铜绿假单胞菌相比，总鼠李糖脂产量均有不同程度提高，毒力水平均有所降低，部分重组菌提升了产物中双鼠李糖脂占比。重组菌提升了产物中双鼠李糖脂占比。重组菌提升了产物中双鼠李糖脂占比。

【技术实现步骤摘要】
减毒铜绿假单胞菌工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及基于一株高产双鼠李糖脂的铜绿假单胞菌JLDR7进行遗传改造，降低其菌株毒性，使其更适合于工业生产。

技术介绍

[0002]铜绿假单胞菌又称为绿脓杆菌，是一种环境微生物，广泛分布于水、土壤等自然环境中，同时也是一种条件致病菌。铜绿假单胞菌的致病性源于其含有多种毒力因子，包括生物被膜、菌毛、鞭毛、褐藻多糖、绿脓菌素等。菌毛蛋白(PilA)是组成菌毛的重要结构单体，通过介导菌株的运动而粘附于不同宿主表面，启动宿主感染，菌毛还与生物被膜生产和多药耐药性的不同模式有关。铜绿假单胞菌的鞭毛主要由鞭毛蛋白(FliC)及其它基体成分组成。鞭毛中的FliC蛋白会与肺部上皮细胞表面的膜糖脂结合，引发肺部病变。
[0003]铜绿假单胞菌能造成感染的另一重要原因是极易形成生物被膜。生物被膜能够将微生物包裹在其中，抵抗抗生素或免疫细胞对微生物的清除。胞外多糖Psl和Alginate是胞外多聚基质的重要组分，能促进菌细胞在介质表面的粘附，维持生物被膜结构。褐藻多糖含有的乙酰基团赋予它高粘性，增强细菌粘附在肺部的持久性，并清除被激活的巨噬细胞和中性粒细胞释放的活性氧，保护铜绿假单胞菌在肺部免受宿主吞噬作用的影响，引发肺部炎症。绿脓菌素(pyocyanin,PCN)是铜绿假单胞菌产生的一种蓝绿色的、有活性的氧化还原次级代谢产物，不仅会使菌落呈现蓝绿色，还是一种致病因子和促炎介质。绿脓菌素进入宿主细胞后会对呼吸链产生抑制作用，改变胞内氧化还原水平并对宿主造成氧化伤害。
[0004]铜绿假单胞菌条件致病性限制了其在工业化生产鼠李糖脂中的应用，为降低菌株毒力水平，选择其典型毒力因子菌毛(pilA)、鞭毛(fliC)、生物被膜多糖(psl)、褐藻多糖(algD)和绿脓菌素(phzA1G1、phzA2G2)作为基因敲除靶点，对菌株进行改造。敲除群体感应抑制基因(mexT、qscR)上调菌株LasR/LasI和RhlR/RhlI群体感应水平，从而提高双鼠李糖脂的生产水平。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种通过调控毒力因子和群体感应抑制因子的转录水平来降低菌株毒力水平并提高鼠李糖脂产量的方法。
[0006]为实现上述技术技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种减毒铜绿假单胞菌工程菌，通过敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT基因，以及pilA、fliC、algD、phzA2G2、qscR中的1个或多个基因，获取所述工程菌。
[0008]本专利技术通过对毒力因子PilA、FliC、Psl、Alginate、Pyocyanin、MexT和QscR中的一个或多个进行失活来实现毒力水平的降低和群体感应水平的提升。PilA、FliC、Psl、Alginate、Pyocyanin是铜绿假单胞菌中的具有代表性的毒力因子，参与调控铜绿假单胞菌对环境的适应和耐药性等，MexT和QscR抑制群体感应系统中LasR/LasI和RhlR/RhlI水平。通过不同的基因敲除组合，鼠李糖脂的产量菌高于原菌株，且相对原菌株毒力水平也有显
著降低。
[0009]作为一种优选的实施方式，敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT基因；
[0010]或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA基因；
[0011]或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC基因；
[0012]或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC、algD、phzA2G2、qscR基因；
[0013]或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC、algD、phzA1G1、phzA2G2、qscR基因，获取所述工程菌。
[0014]作为一种优选的实施方式，敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT基因；
[0015]或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA基因；
[0016]或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC、algD、phzA2G2、qscR基因，获取所述工程菌。
[0017]该实施方式中构建的三种工程菌，除毒力水平降低、鼠李糖脂产量增加外，产物中双鼠李糖脂比例也高于原始菌株。
[0018]作为一种优选的实施方式，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌JLDR7。本专利技术使用的铜绿假单胞菌可以为铜绿假单胞菌野生菌株JLDR7或者其他能够产生鼠李糖脂或者具备产生鼠李糖脂的潜力的铜绿假单胞菌，对于菌株的所属株系也并无特别限定，可以为铜绿假单胞菌野生株系也可以通过人工或自然突变或改造获得的菌株。理论上采用其他种属的鼠李糖脂生产菌株也可实现，如假单胞菌属的鼠李糖脂生产菌株。铜绿假单胞菌JLDR7为一种优选的示例。
[0019]本专利技术的第二目的在于提供上述减毒铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，包括：
[0020]1)扩增psl基因的上下游臂；
[0021]2)将上下游臂和线性化载体进行重组连接，构建psl敲除的重组质粒；
[0022]3)将所述重组质粒转化到铜绿假单胞菌中，经同源交换和筛选后获得psl缺失的菌株；
[0023]4)采用相同方式敲除其他基因。
[0024]本专利技术的第三目的在于提供上述减毒铜绿假单胞菌工程菌在发酵产鼠李糖脂中的应用。
[0025]作为一种优选的实施方式，摇瓶培养时，所述减毒铜绿假单胞菌工程菌以甘油为碳源发酵生产鼠李糖脂。
[0026]作为一种优选的实施方式，发酵罐放大培养时，所述减毒铜绿假单胞菌工程菌以菜籽油为碳源发酵生产鼠李糖脂。
[0027]作为一种优选的实施方式，发酵罐放大培养时，所述减毒铜绿假单胞菌工程菌以无机氮源为碳源发酵生产鼠李糖脂。
[0028]作为一种优选的实施方式，将所述减毒铜绿假单胞菌工程菌在营养肉汤培养基中进行种子培养后，种子液接种至发酵培养基发酵培养。
[0029]目前，对于利用铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂的研究中，大多从鼠李糖脂代谢途径及其副产物竞争途径着手进行基因工程改造，很多改造只能锚定一两个点进行改造，对于鼠李糖脂产量的提升效果有限。本专利技术通过在铜绿假单胞菌中抑制psl、pilA、fliC、algD、phzA1G1、phzA2G2、mexT、qscR基因的表达，构建了重组菌JLDR7
‑
1～JLDR7
‑
7，重组菌与作为
Pseudomonas aeruginosa genome with two
‑
step allelic exchange.Nature Protocol,2015,10(11):1820
‑
1841。敲除质粒为pEX18Gm，将对该基因编码区第38
‑
1437bp的片段进行敲除。根据psl基因序列设计引物，扩增其上下游同源片段。用于同源臂扩增的引物如下：
[0045]psl_本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减毒铜绿假单胞菌工程菌，其特征在于，通过敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT基因，以及pilA、fliC、algD、phzA2G2、qscR中的1个或多个基因，获取所述工程菌。2.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌工程菌，其特征在于，敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT基因；或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA基因；或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC基因；或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC、algD、phzA2G2、qscR基因；或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC、algD、phzA1G1、phzA2G2、qscR基因，获取所述工程菌。3.根据权利要求2所述的减毒铜绿假单胞菌工程菌，其特征在于，敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT基因；或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA基因；或敲除铜绿假单胞菌中的psl、mexT、pilA、fliC、algD、phzA2G2、qscR基因，获取所述工程菌。4.根据权利要求1～3任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安明，茅佳佳，钱秀娟，董维亮，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：