一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用技术

一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用，分别在嗜甲烷菌宿主中敲除L

【技术实现步骤摘要】
一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]面对地球平均温度的稳步上升及其对环境的相关不利影响，各国提出了减少温室气体的倡议。甲烷(CH4)是全球排放的第二大温室气体，占温室气体排放总量的12％，其全球变暖潜势是CO2的25倍。为了响应我国提出的双碳战略的号召，推进甲烷减排是重要策略之一。
[0003]四氢嘧啶是一种相容性溶质，可在多种耐盐细菌中维持渗透平衡。四氢嘧啶能够作为酶、蛋白质复合物、核酸和细胞膜的稳定剂，能在冷冻、高温、高紫外线辐射等极端条件下保护微生物，是微生物合成的最有价值的生物产品之一。目前，四氢嘧啶已经应用于医药、化妆品、食品和生物制剂等多个领域，年产量约为15000吨，价格约为1000美元/千克。目前工业上利用嗜盐微生物生产四氢嘧啶，尽管该工业过程具备丰富的设计经验和操作经验，但该过程以葡萄糖作为碳源使得成本高昂，降低了成本效益，并存在与粮食作物土地和食品市场竞争的问题。
[0004]嗜甲烷菌是以甲烷作为唯一碳源的微生物，是将甲烷转化为增值化学品和燃料的重要工业生物催化剂。近年来，在间歇式和连续式生物反应器中进行的研究表明，嗜甲烷菌可以表达参与四氢嘧啶合成的基因簇，能够利用甲烷合成四氢嘧啶。因此，利用其这一特性有望降低四氢嘧啶生产的成本及促进甲烷减排。尽管目前已经研究出嗜甲烷菌的全基因组序列和C1同化途径，但是利用甲烷合成的四氢嘧啶产量低，限制了基于嗜甲烷菌的四氢嘧啶工业生产的开发。因此通过对野生型嗜甲烷菌进行基因工程改造有望提高其四氢嘧啶的浓度。
[0005]专利申请CN202211421954.0公布了一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，在hom和dapA基因位置整合了由乳糖启动子Ptac控制的T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，同时引入可诱导表达的T7RNA聚合酶基因；在pck基因位置整合了由T7强启动子控制来源于谷氨酸棒杆菌的lysC基因；导入重组载体pXMJ19
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T7
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ectABC，构建由T7强启动子控制的L
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天冬氨酸
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β
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半醛到四氢嘧啶的合成通路。但是该专利申请是以葡萄糖为底物合成四氢嘧啶的谷氨酸棒杆工程菌，无法利用甲烷。

技术实现思路

[0006]为了解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用，通过代谢工程改造增加四氢嘧啶合成前体二氨基丁酸及阻断四氢嘧啶降解为N
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α
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乙酰基
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L
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2,4
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二氨基丁酸路径，并将其应用在四氢嘧啶的生产中，实现嗜甲烷菌合成四氢嘧啶的过程强化。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，该嗜甲烷菌宿主单敲除了L
‑
2,4
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二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD、四氢嘧啶水解酶编码基因doeA或丙酮酸激酶编码基因pykA；或者该嗜甲烷菌宿主过表达了天冬氨酸激酶编码基因ask；或者该嗜甲烷菌宿主双敲除了L
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2,4
‑
二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD和四氢嘧啶水解酶编码基因doeA；
[0009]所述基因doeD的核苷酸序列如图SEQ ID NO.1所示；
[0010]所述基因doeA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.2所示；
[0011]所述基因pykA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.3所示；
[0012]所述基因ask的核苷酸序列如图SEQ ID NO.4所示；
[0013]所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种或任意比例多种。
[0014]一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
[0015]利用重叠PCR将doeD的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE01。
[0016]一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
[0017]利用重叠PCR将doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE02。
[0018]一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
[0019]利用重叠PCR将pykA的上下游同源臂与抗性基因相连得到pykA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的pykA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE03。
[0020]一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
[0021]将基因ask与质粒pAWP89线性化载体相连构建重组质粒P01(pAWP89::ask)，然后转入嗜甲烷菌中，得到嗜甲烷工程菌MAHE04。
[0022]一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
[0023]利用重叠PCR将doeD和doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD和doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE05。
[0024]本专利技术提供一种上述构建方法得到的嗜甲烷工程菌MAHE01
‑
05在产四氢嘧啶上的应用，包括如下步骤：
[0025](1)将嗜甲烷工程菌经菌种活化、种子培养后，以体积分数5％
‑
25％的接种量接种至氯化钠浓度为7.5
‑
60g/L的液体NMS培养基中，于25
‑
35℃、150rpm
‑
300rpm的条件下培养60
‑
96h，培养体系采用可封闭的气液两相体系，培养初始及过程中向培养体系内补充甲烷，甲烷的添加量为培养体系气相体积的4％
‑
30％；
[0026](2)取步骤(1)培养过程中的菌液，离心收获菌体，对菌体重悬后超声破碎并冷冻
离心，将上清液过滤后获得四氢嘧啶；
[0027]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，其特征在于，该嗜甲烷菌宿主单敲除了L
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2,4
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二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD、四氢嘧啶水解酶编码基因doeA或丙酮酸激酶编码基因pykA；或者该嗜甲烷菌宿主过表达了天冬氨酸激酶编码基因ask；或者该嗜甲烷菌宿主双敲除了L
‑
2,4
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二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD和四氢嘧啶水解酶编码基因doeA；所述基因doeD的核苷酸序列如图SEQ ID NO.1所示；所述基因doeA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.2所示；所述基因pykA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.3所示；所述基因ask的核苷酸序列如图SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种或任意比例多种。3.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：利用重叠PCR将doeD的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE01。4.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：利用重叠PCR将doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE02。5.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：利用重叠PCR将pykA的上下游同源臂与抗性基因相连得到pykA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的pykA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE03。6.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：将基因ask与质粒pAWP89线性化载体相连构建重组质粒P01(pAWP89::ask)，然后转入嗜甲烷菌中，得到嗜甲烷工程菌MAHE04。7.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：利用重叠PCR将doeD和doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD和doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE05。
8.基于上述根据权利要求3
‑
7构建方法得到的嗜甲烷工程菌MAHE01
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05在产四氢嘧啶上的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)将嗜甲烷工程菌经菌种活化、种子培养后，以体积分数5％
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25％的接种量接种至氯化钠浓度为7.5
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60g/L的液体NMS培养基中，于25
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35℃、150rpm
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300rpm的条件下培养60
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96h，培养体系采用可封闭的气液两相体系，培养初始及过程中向培养体系内补充甲烷，甲烷的添加量为培养体系气相体积的4％
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【专利技术属性】
技术研发人员：费强，苏玥航，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：