一种产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌，其为基因组中包含编码丝氨酸O

【技术实现步骤摘要】
一种产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌及其制备与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌及其制备与应用。

技术介绍

[0002]硒(Se)是多种生物中重要的微量元素，可以通过硒代半胱氨酸(SeCys)和2
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硒丙啶插入蛋白质和核酸中。硒
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甲基硒代半胱氨酸(SeMCys)作为甲基硒醇的直接前体，可作为膳食硒补充剂，并通过减少肿瘤生长和转移能力应用于联合化疗。
[0003]目前SeMCys的制备方法主要是化学合成法，但是这些化学合成方法存在步骤复杂、工艺冗长、反应条件苛刻和环境不友好等问题。
[0004]SeMCys的生物合成自然发生在西兰花和黄芪中，它们是硒的超积累植物。硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)是负责SeCys甲基化以合成SeMCys的关键酶。在过度生产S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体的酿酒酵母中表达植物来源的SMT为该菌株提供了1.140μg/g干细胞重量(DCW)的SeMCys产量。基于SMT的过度表达和表达来源于酿酒酵母的S
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腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM2)提高SAM产量，通过并提高细胞内SeCys水平，申请人已经优化了枯草芽孢杆菌中SeMCys的生产(Yin X,Zhou Y,Yang H,Liao Y,Ma T,Wang F.Enhanced selenocysteine biosynthesis for seleno
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methylselenocysteine production in Bacillus subtilis.Appl Microbiol Biotechnol.2023；107(9):2843
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54.https://doi.org/10.1007/s00253
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023
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8)，将异源基因整合菌株GBACB在补料分批培养中以18μg/L的速度生产SeMCys，但是，该菌株的产量仍然偏低。
[0005]因此，目前存在的问题是亟需构建一种提高甲基硒代半胱氨酸的产量的基因工程菌。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌，采用该基因工程菌生产甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本，制备过程不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；利用该基因工程菌有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。
[0007]本专利技术第一方面提供了一种产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌，其合成甲基硒代半胱氨酸的途径如下：
[0008](1)丝氨酸(Ser)在拟南芥来源的丝氨酸O
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乙酰转移酶(SATp)作用下合成O
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乙酰丝氨酸；
[0009](2)O
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乙酰丝氨酸解除O
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乙酰丝氨酸硫醇裂解酶(CysK)的表达抑制，并在CysK的作用下合成硒代半胱氨酸(SeCys)；
[0010](3)甲硫氨酸在酿酒酵母来源的S
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腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM2)作用下，合成S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)；
[0011](4)硒代半胱氨酸(SeCys)在双沟黄芪来源的硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)作用下，被S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基化，形成甲基硒代半胱氨酸；
[0012](5)S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)和甲硫氨酸在蛋氨酸S
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甲基转移酶(Mmt)作用下，形成甲基甲硫氨酸(MMet)；
[0013](6)硒代半胱氨酸(SeCys)在硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)作用下，被甲基甲硫氨酸(MMet)甲基化，形成甲基硒代半胱氨酸。
[0014]根据本专利技术的一些实施方式，所述基因工程菌为基因组包含编码丝氨酸O
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乙酰转移酶SATp的基因、编码硒代半胱氨酸甲基转移酶SMT的基因、编码S
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腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2的基因的重组宿主菌，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌168；其中，所述基因工程菌的基因组中还包含编码蛋氨酸S
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甲基转移酶Mmt的基因。
[0015]在本专利技术的一些实施例中，所述编码蛋氨酸S
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甲基转移酶Mmt的基因包括候选异域菌门菌(Candidatus Peregrinibacteria)来源的编码蛋氨酸S
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甲基转移酶CpMmt(简称为CpMmt蛋白)的基因、洋玫瑰变色菌(Roseovarius indicus)来源的编码蛋氨酸S
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甲基转移酶RiMmt(简称为RiMmt蛋白)的基因和新鞘氨醇菌属(Novosphingobiumsp.)MBES04来源的编码蛋氨酸S
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甲基转移酶NmMmt(简称为NmMmt蛋白)的基因。
[0016]优选地，编码蛋氨酸S
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甲基转移酶CpMmt的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，编码蛋氨酸S
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甲基转移酶RiMmt的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，编码蛋氨酸S
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甲基转移酶NmMmt的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017]根据本专利技术的另一些实施方式，所述基因工程菌为经过了底盘改造的产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌；所述底盘改造包括编码半胱氨酸脱硫酶IscSB(简称为IscSB蛋白)的基因、编码氨基转移酶YhdR(YhdR蛋白)的基因和编码丝氨酸脱水酶SdaA的基因簇中的一个或几个的敲除；其中，所述编码丝氨酸脱水酶SdaA的基因簇包括编码丝氨酸脱水酶SdaAA(简称为SdaAA蛋白)的基因和编码丝氨酸脱水酶SdaAB(简称为SdaAA蛋白)的基因。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，编码半胱氨酸脱硫酶IscSB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；和/或，编码氨基转移酶YhdR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；和/或，编码丝氨酸脱水酶SdaAA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；和/或，编码丝氨酸脱水酶SdaAB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0019]本专利技术第二方面提供了如本专利技术第一方面所述的基因工程菌的构建方法，其包括以枯草芽孢杆菌168为宿主菌，将编码蛋氨酸S
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甲基转移酶的基因CpMmt、RiMmt和NmMmt置于P
xylA
启动子下形成P
xylA
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CpMmt、P
xylA
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RiMmt和P
xylA
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NmMmt表达框，将表达框分别插入枯草芽孢杆菌168基因组Kin本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产甲基硒代半胱氨酸的基因工程菌，其合成甲基硒代半胱氨酸的途径如下：(1)丝氨酸(Ser)在拟南芥来源的丝氨酸O
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乙酰转移酶(SATp)作用下合成O
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乙酰丝氨酸；(2)O
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乙酰丝氨酸解除O
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乙酰丝氨酸硫醇裂解酶(CysK)的表达抑制，并在CysK的作用下合成硒代半胱氨酸(SeCys)；(3)甲硫氨酸在酿酒酵母来源的S
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腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM2)作用下，合成S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)；(4)硒代半胱氨酸(SeCys)在双沟黄芪来源的硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)作用下，被S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基化，形成甲基硒代半胱氨酸；(5)S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)和甲硫氨酸在蛋氨酸S
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甲基转移酶(Mmt)作用下，形成甲基甲硫氨酸(MMet)；(6)硒代半胱氨酸(SeCys)在硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)作用下，被甲基甲硫氨酸(MMet)甲基化，形成甲基硒代半胱氨酸。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为基因组包含编码丝氨酸O
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乙酰转移酶SATp的基因、编码硒代半胱氨酸甲基转移酶SMT的基因、编码S
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腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2的基因的重组宿主菌，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌168；其中，所述基因工程菌的基因组中还包含编码蛋氨酸S
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甲基转移酶Mmt的基因。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码蛋氨酸S
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甲基转移酶Mmt的基因包括候选异域菌门菌(Candidatus Peregrinibacteria)来源的编码蛋氨酸S
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甲基转移酶CpMmt的基因、洋玫瑰变色菌(Roseovarius indicus)来源的编码蛋氨酸S
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甲基转移酶RiMmt的基因和新鞘氨醇菌属(Novosphingobiumsp.)MBES04来源的编码蛋氨酸S
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甲基转移酶NmMmt的基因。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，编码蛋氨酸S
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甲基转移酶CpMmt的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，编码蛋氨酸S
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甲基转移酶RiMmt的基因的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷娴，王凤寰，廖永红，赵美怡，周瑜，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：