一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及微生物代谢工程技术领域，尤其涉及一种高产D

【技术实现步骤摘要】
一种高产D
‑
泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及微生物代谢工程
，尤其涉及一种高产D
‑
泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]D
‑
泛酸(DPA)，又称维生素B5，是一种水溶性维生素，是用于生物合成辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白的关键前体。作一种重要的维生素常被用于医疗保健、化妆品、动物食品和饲料等行业，具有很高的商业价值。
[0003]目前，用于工业应用的D
‑
泛酸主要利用D
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泛内酯和β
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丙氨酸在甲醇或乙醇中缩合的化学方法进行生产。然而，使用化学分离或D
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泛内酯的酶催化产生的D
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泛内酯涉及到有毒的化学试剂和昂贵的分离手段。随着基因工程和合成生物学的不断发展，利用环保、廉价和简单等特点的生物合成手段生产D
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泛酸引起了学者们的广泛关注。D
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泛酸的微生物合成法利用的是D
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泛内酯和β
‑
丙氨酸在生物体中的缩合反应产生的。其中，β
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丙氨酸作为天冬氨酸家族氨基酸的衍生物由panD编码天冬氨酸1
‑
脱羧酶直接从天冬氨酸合成。D
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泛内酯由丙酮酸开始经过乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、α
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酮异戊酸羟甲基转移酶和泛酸还原酶反应催化产生。
[0004]大肠杆菌作为一种工业微生物具有遗传背景清晰、操作简单等优势是生产D
‑
泛酸的理想底盘。细胞衰老是微生物细胞随着年龄增长而发生的退行性功能变化的总和，会降低细胞维持稳态的能力并增加细胞死亡的风险，是大肠杆菌和酿酒酵母等单细胞微生物的最基本生理特征之一，可分为复制型衰老和时序型衰老。根据这两种类型的衰老衍生出两种改善微生物寿命的策略即改善微生物复制寿命与时序寿命。江南大学刘立明团队成功的改善了大肠杆菌的寿命，并且运用于赖氨酸的实际生产中。经过长期的实验研究发现，在实际生产D
‑
泛酸的过程中会也会面临着发酵过程中前期菌体生长(OD600)增长过慢，达到一定的OD时间过长，导致发酵周期延长，不利于工业化生产；菌体的活力不够，随着对生产菌株的基因型改造，造成菌株提前衰老，生产性能严重下降的问题。目前，还未有使用改善大肠杆菌寿命的策略解决以上问题并提高D
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泛酸产量的资料与研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种高产D
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泛酸的基因工程菌及其构建方法，并将其应用于发酵生产D
‑
泛酸，以克服现有技术中因D
‑
泛酸生产菌株发酵周期长，容易提前衰老，导致菌株的D
‑
泛酸生产性能较低的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术的第一个目的在于，提供一种高产D
‑
泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：以菌株E.coli W3110 Trc
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panC/Trc
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panE/Trc
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panB/Trc
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ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE
*
/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc
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pykA/ilvN
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/ilvH
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/Trc
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spoT
*
/Trc
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lpd/Trc
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ilvD/ΔlacI
*
作为出发菌株，敲除其基因组中的葡萄糖特异性酶编码基因ptsG、压力响应调节因子编码基因rssB、硫辛酸合酶编码基因lipA、甲基转移酶编码基因ubiG、阻遏碳储存调控因子编码基因csrB、假基因yghX和假基因ompT，过表达碳储存调控因子编码基因csrA、影响电子传递链的σS或σ38因子编码基因rpoS、低氧诱导因子编码基因arcA、RNA分子伴侣编码基因hfQ、半乳糖渗透酶编码基因galP和葡萄糖激酶编码基因glK，即得到所述高产D
‑
泛酸的基因工程菌。
[0007]研究表明大肠杆菌的寿命与胁迫应激响应途径和电子传递链有关，因此，选择与胁迫应激响应途径和电子传递链相关的靶点用于调控大肠杆菌的细胞寿命，例如，压力响应调节因子(rssB)、碳储存调控因子(csrA)、类组氨酸蛋白(hns)、蛋白酶(lon)、σS(或σ38)因子(rpoS)、低氧诱导因子(arcA)、甲基转移酶(ubiG)、硫辛酸合酶(lipA)、琥珀酸脱氢酶(sdhA)、糖原合酶(glg)和正向激活因子(rscA)等。
[0008]本专利技术中的出发菌株E.coli W3110 Trc
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panC/Trc
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panE/Trc
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panB/Trc
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ilvC/ilvG/ΔavcA/il vE
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/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc
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pykA/ilvN
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/ilvH
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/Trc
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spoT
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/Trc
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lpd/Trc
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ilvD/ΔlacI
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已在专利CN113278569A中公开，来自浙江工业大学生物工程学院合成生物技术研究所菌种库。由于PTS途径中葡萄糖特异性酶IIBC(ptsG)SEQ ID NO.1在转运葡萄糖的过程中会利用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)中的磷酸基团，使葡萄糖磷酸化为6
‑
磷酸葡萄糖(G6P)。近50％的PEP被消耗用于PEP转化为G6P，这会造成D
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泛酸生产过程中由于丙酮酸(PYR)供应不足导致的代谢流减弱致D
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泛酸产量的降低。因此利用CRISPR
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Cas9系统敲除磷酸转移酶系统(PTS)中ptsG基因，并在此基因位点过表达不消耗PEP的半乳糖渗透酶/葡萄糖激酶(galP/gl K)系统来取代除磷酸转移酶系统(PTS)对于葡萄糖的转运，具体相关文献可参考：Fujiwa
‑
ra R,Nakano M,Hirata Y,et al.G6P
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capturing molecules in the periplasm of Escherichi
‑
a coli accelerate the shikimate pathway[J].Metabolic engineering,2022,72:68
‑
81，得到菌株DPan16S并以此为底盘菌株。
[0009]以先前构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建获得：以菌株E.coliW3110Trc
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panC/Trc
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panE/Trc
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panB/Trc
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ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE
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/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc
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pykA/ilvN
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/ilvH
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/Trc
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spoT
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/Trc
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lpd/Trc
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ilvD/ΔlacI
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作为出发菌株，敲除其基因组中的葡萄糖特异性酶编码基因ptsG、压力响应调节因子编码基因rssB、硫辛酸合酶编码基因lipA、甲基转移酶编码基因ubiG、阻遏碳储存调控因子编码基因csrB、假基因yghX和假基因ompT，过表达碳储存调控因子编码基因csrA、影响电子传递链的σS或σ38因子编码基因rpoS、低氧诱导因子编码基因arcA、RNA分子伴侣编码基因hfQ、半乳糖渗透酶编码基因galP和葡萄糖激酶编码基因glK，即得到所述高产D
‑
泛酸的基因工程菌。2.如权利要求1所述的一种高产D
‑
泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因rpoS和基因arcA整合在所述假基因yghX位点。3.如权利要求1或2所述的一种高产D
‑
泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因csrA整合在所述基因csrB位点。4.如权利要求1或2所述的一种高产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因hfQ整合在所述假基因ompT位点。5.如权利要求1或2所述的一种高产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因rpoS已经进行第二密码子优化，其序列如SEQ ID NO.9所示。6.如权利要求1所述的一种高产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因csrA、基因rpoS、基因arcA、基因galP和基因glK由启动子Trc启动，所述启动子Trc的序列如SEQ ID NO.12所示。7.如权利要求1或6所述的一种高产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因hfQ由自身的启动子启动，...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，随兰多，黄良刚，姚远，周俊平，张博，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：