一种生产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种生产D

【技术实现步骤摘要】
一种生产D
‑
泛酸的基因工程菌、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种生产D
‑
泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]D
‑
泛酸(DPA)作为辅酶A的组成物质参与调节蛋白质、糖和脂肪的代谢，改善毛发色泽并预防疾病。特别是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成和分解，都不可缺少对泛酸钙的需求。缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓、生殖机能发生障碍、适应性降低。D
‑
泛酸钙作为B族维生素，在国内外广泛应用于医药工业，其单方制剂主要适应症为泛酸缺乏症，复合维生素B和多种维生素制剂主要用于补充维生素，而与不同组分配伍的复方制剂适应症更广，如胃肠道疾病、呼吸道疾病、皮肤病、精神不振、神经衰弱等。另外，泛酸钙还用于保健食品。目前国内外很多保健品都添加泛酸钙，如养生堂的“成人维生素”、“成长快乐”等。
[0003]D
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泛酸可以由微生物和植物合成，但无法由其他动物和人类合成。
[0004]目前主要有三种生产D
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泛酸的方法：化学合成法、酶催化法、发酵合成法。
[0005]化学合成法先制备D，L
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泛解酸内酯与β
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丙氨酸，然后在甲醇或乙醇中加热混合物进行生产。D，L
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泛解酸内酯主要由异丁醛和甲醛通过醛缩合，然后在酸性条件下加入氢氰酸进行皂化反应制备得到；β
‑
丙氨酸主要通过丙烯腈或丙烯酸的氨化或通过β
‑
氨基丙腈的羟基化反应来制备。此法生产D
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泛酸能耗偏高，存在较为繁琐的光学拆分，且涉及剧毒原料如氢氰酸或氰化钠等的使用，同时存在含氰化物的废水污染问题。
[0006]酶催化法通过微生物来源的泛酸合成酶以D
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泛解酸和β
‑
丙氨酸为底物合成D
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泛酸。由于只有D构型的产品合成，酶催化法避免了繁琐和耗时的光学纯化，但前体仍需化学合成。
[0007]发酵合成法通过微生物以葡萄糖等碳源作为底物生产目标产物，具有环境友好，反应温和，产物光学纯度高等优点。在微生物中，D
‑
泛解酸与β
‑
丙氨酸可以分别通过D
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泛解酸途径与β
‑
丙氨酸途径合成。D
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泛解酸途径从葡萄糖经糖酵解获得丙酮酸开始，先在乙酰乳酸合成酶催化下生成乙酰乳酸，再通过酮泛解酸还原酶催化生成2,3
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二羟基异戊酸，并在二羟酸脱水酶作用下得到α
‑
酮异戊酸。在3
‑
甲基
‑2‑
羟甲基转移酶作用下生成酮泛解酸，最后经过酮泛解酸还原酶作用生成泛解酸，经泛酸合成酶催化D
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泛解酸与β
‑
丙氨酸生成D
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泛酸。有关D
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泛酸的发酵合成法生产，事实上主要是通过构建泛解酸高产菌株，然后通过外源添加β
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丙氨酸的方式来生产D
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泛酸。如在US6686183专利中，通过对抗缬氨酸菌株FE6进行了一系列改造，去获取D
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泛酸高产量菌株。但仍存在一定的缺陷与问题，例如生物合成途径的复杂性和严格的控制导致发酵过程不稳定、产量不高等问题。
[0008]基于群体感应(QS)的动态调控是指微生物通过自身的群体行为来实现对环境的适应和生存。微生物通过一些特殊的分子信号来感知周围环境，当微生物数量达到一定程度时，这些信号会触发群体感应反应，从而导致群体行为的改变。基于群体感应的动态调控
已被广泛应用，作为一种基本工具，在细胞密度变化的反应中微调基因表达，而无需添加昂贵的诱导物。然而，在大多数报道中，QS系统主要依赖于表达的下调而不是表达的上调，这极大地限制了它们作为控制代谢通量的分子开关的潜力。

技术实现思路

[0009]为了解决上述提高D
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泛酸产量的技术问题，本专利技术提供了一种生产D
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泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。本专利技术的目的在于通过。
[0010]本专利技术的具体技术方案为：本专利技术提供了一种生产D
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泛酸的基因工程菌，其构建方法包括以下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌来源的panB、panC、panD基因以及ilvD基因分别与p43启动子融合，并同时整合入B.subtilis 168基因组中进行过表达，得到菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD ilvD；(2)将菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD ilvD基因组中的ilvA基因敲除，得到工程菌株B.subtilis168p43
‑
panBCD ilvDΔilvA；(3)将枯草芽孢杆菌来源的alsS基因与p43启动子融合，并整合入菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T ilvDΔilvA基因组中进行过表达，得到工程菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvDΔilvA；(4)将枯草芽孢杆菌来源的panE基因与p43启动子融合，并整合入B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvDΔilvA基因组中进行过表达，得到菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvD panEΔilvA；(5)将枯草芽孢杆菌来源的ptsG基因与P
srfAA11
启动子融合，并整合入B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvD panEΔilvA基因组中进行过表达，得到菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvD panE P
srfAA11
‑
ptsGΔilvA，即所述生产D
‑
泛酸的基因工程菌。
[0011]作为上述技术方案的优选，所述P
srfAA11
启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]作为上述技术方案的优选，所述panB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]作为上述技术方案的优选，所述panD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014]本专利技术还提供了上述基因工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：(1)利用融合PCR技术将p43启动子与枯草芽孢杆菌来源的panBCD操纵子整合于B.subtilis168基因组中，得到菌株B.subtilis MM
‑
0；(2)以B.subtilis 168本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产D
‑
泛酸的基因工程菌，其特征在于：其构建方法包括以下步骤：S1：将枯草芽孢杆菌来源的panB、panC、panD基因以及ilvD基因分别与p43启动子融合，并同时整合入B.subtilis 168基因组中进行过表达，得到菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD ilvD；S2：将菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD ilvD基因组中的ilvA基因敲除，得到工程菌株B.subtilis168p43
‑
panBCD ilvDΔilvA；S3：将枯草芽孢杆菌来源的alsS基因与p43启动子融合，并整合入菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T ilvDΔilvA基因组中进行过表达，得到工程菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvDΔilvA；S4：将枯草芽孢杆菌来源的panE基因与p43启动子融合，并整合入B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T
alsS ilvDΔilvA基因组中进行过表达，得到菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvD panEΔilvA；S5：将枯草芽孢杆菌来源的ptsG基因与P
srfAA11
启动子融合，并整合入B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T alsS ilvD panEΔilvA基因组中进行过表达，得到菌株B.subtilis 168p43
‑
panBCD
T
alsS ilvD panE P
srfAA11
‑
ptsGΔilvA，即所述生产D
‑
泛酸的基因工程菌。2.如权利要求1所述的一种生产D
‑
泛酸的基因工程菌，其特征在于：所述P
srfAA11
启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的一种生产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于：所述panB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求1所述的一种生产D
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泛酸的基因工程菌，其特征在于：所述panD基因的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，原攀红，徐孟涛，郑涵，茅呈耀，孙志永，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：