一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用制造技术

本发明专利技术提出了一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌MG1655，编号为ATCC 47076为宿主，其包含如下改造：基于丙酮酸响应转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入PdhR结合位点PdhR Box，使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建得到受丙酮酸调控的Ppr启动子；外源引入T7RNAP，在PxylF下表达；外源引入密码子优化的ectABC基因簇，一个拷贝在T7启动子下，另一个拷贝在构建的受丙酮酸调控的强启动子Ppr启动子下；在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和天冬氨酸激酶基因lysC；通过反义转录抑制thrA、lysA、iclR和zwf基因的表达。本申请工程菌能够生产依克多因，并具有较高的产量。并具有较高的产量。并具有较高的产量。

【技术实现步骤摘要】
一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用。

技术介绍

[0002]依克多因(1, 4, 5, 6
‑
tetrahydro
‑2‑
methyl
‑4‑
pyrim
‑
idinecarboxylic acid, ectoine)，又名四氢嘧啶，1，4，5，6
‑
四氢
‑2‑
甲基
‑4‑
嘧啶羧酸，是一种嘧啶类衍生物，也是一种环化的氨基酸衍生物，具有高度水溶性、生理pH范围内不带电荷的特点。1985年Galinski等人首次在一株极端嗜盐菌光养型紫色硫细菌（Halorhodospira halochloris）中发现依克多因，并通过核磁共振、质谱和红外光谱鉴定并分离出依克多因。目前已发现依克多因可在耐盐或嗜盐细菌、古菌、放线菌以及真菌等微生物细胞内积聚。依克多因类相容性溶质在外界极端环境（冷冻、干旱、高盐碱、高温、射线等）对细胞进行保护。主要在高盐浓度下，作为渗透压补偿溶质在某些嗜盐或耐盐的细菌、古菌等微生物细胞内大量的累积，以抵抗外界环境高渗透压的改变。作为生物大分子保护剂，依克多因对酶、核酸、蛋白质的结构起到保护作用。因此，依克多因被广泛应用于化妆品、医药、酶工业、生物技术等领域。
[0003]目前，依克多因的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法具有环境污染，反应条件苛刻，成本高等缺点。生物合成法分为酶催化法和生物发酵法。酶催化法由于需要添加诱导剂和操作工艺复杂，传统的生物发酵法常用嗜盐或耐盐细菌，主要生产工艺为“细菌挤奶”法，即通过渗透压的循环控制，高盐、高渗的外界环境诱导细胞合成依克多因，低盐、低渗环境刺激促进释放。该方法使用的高盐环境造成设备腐蚀、细胞生长受抑制、后提取难度增加等问题，进而增大依克多因的生产成本，制约依克多因规模化生产和应用。
[0004]经研究表明，产依克多因的嗜盐或耐盐菌中存在一条以天冬氨酸为前体的依克多因合成途径，主要由三个关键基因（ectA、ectB、ectC）编码的三个酶（EctA、EctB、EctC）参与，并且三个基因通常是以ectABC的形式组成一个操纵子单元。天冬氨酸在天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶作用下生成L
‑
天冬氨酸
‑4‑
半醛后，二氨基丁酸转氨酶(EctB)催化L
‑
天冬氨酸
‑4‑
半醛转化为L
‑
2，4
‑
二氨基丁酸（DABA），该产物随后被L
‑
二氨基丁酸转移酶(EctA)催化生成N
‑
乙酰基
‑
2，4
‑
二氨基丁酸（ADABA），最后ADABA在四氢嘧啶合酶(EctC)的催化作用下生成反应终产物依克多因。将嗜盐菌中依克多因合成途径的三个关键基因ectA、ectB、ectC转入非嗜盐菌株，进行依克多因合成途径的重构，利用异源表达的大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母菌等进行依克多因的生产，可以有效地避免“细菌挤奶法”存在的问题，是工业生产中越来越普遍应用的方法。大肠杆菌作为微生物发酵工业中最广泛应用的菌株，具有遗传背景清晰、发酵周期短、成本低和易于基因改造等优点，被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，是发酵合成依克多因的优势平台。
[0005]糖酵解途径是维持细胞生长的关键中心代谢途径，为细胞生长和产物合成提供碳骨架，过高的糖酵解途径代谢流会导致代谢溢流，使更多的碳骨架流向细胞生长并生成副产物，而过低的糖酵解途径代谢流会影响细胞生长，导致产物合成效率下降。因此，合理、精
准地控制糖酵解途径的代谢通量是实现目标产物高效合成的关键要素之一。丙酮酸是连接糖酵解途径与TCA循环的关键碳中心代谢物，碳源的两条利用途径PTS途径和NPTS途径都会流入糖酵解途径生成丙酮酸，为细胞提供碳骨架，或继续进入TCA循环转换成为氮源、ATP或者还原力。丙酮酸响应转录因子PdhR 在大肠杆菌中是一种多效型的转录因子，能够响应胞内丙酮酸浓度，调控多个代谢节点，从而维持胞内中心代谢的稳态。当胞内丙酮酸浓度较低时，丙酮酸响应转录因子PdhR 会与靶基因的启动子区结合，阻碍RNA 聚合酶与启动子结合，从而抑制基因的转录；当胞内丙酮酸浓度达到一定阈值时，丙酮酸会与丙酮酸响应转录因子 PdhR 结合，使其从靶基因的启动子区脱落，解除丙酮酸响应转录因子 PdhR 的抑制效果基于丙酮酸响应转录因子PdhR。本专利技术在T7启动子的下游插入PdhR结合位点PdhR Box（ATTGGTATGACCAAT），使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，从而获得受丙酮酸调控的Ppr启动子，进而在该Ppr启动子控制下进行外源基因的表达，同时Ppr启动子控制下进行糖代谢和氨基酸代谢调控基因表达的增强和抑制，可以实现根据细胞中丙酮酸的浓度水平，对糖代谢流进行精准、合理地调控，动态增加氨基酸和糖代谢支流，在不影响宿主菌正常生长和能量供应的情况下将代谢流导向产品依克多因，提高依克多因的产量。
[0006]反义转录是一种普遍存在与多种生物中的调节系统,其主要作用方式可分为两种类型：产生反义RNA（ asRNA）或转录干扰。其中asRNA可以与目的基因的mRNA结合，降低其稳定性和翻译效率，从而抑制目的基因的表达；而转录干扰则发生在RNA聚合酶（RNAP）之间，当两个RNAP的延伸方向相反时，二者会发生物理碰撞，导致其从DNA链上脱落，从而干扰mRNA的有效合成。本专利技术分别在thrA、lysA、iclR和zwf基因下游插入反向的Ppr启动子，通过反义转录抑制基因的表达，减少氨基酸和糖代谢支流的通量。
[0007]谢希贤等（CN106754603B）公布了利用木糖诱导产生依克多因的基因工程菌及其应用，该基因工程菌为具有特定基因型的大肠杆菌，包含T7启动子控制的来源于伸长盐单胞菌的ectABC基因；thrA，iclR两个基因缺陷型；具有T7启动子控制来自谷氨酸棒状杆菌的lysC基因；trc启动子控制的ppc基因；木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；摇瓶发酵20
‑
28h后依克多因的产量达到了12
‑
16g/L，5L发酵罐发酵24
‑
40h后依克多因的产量达到了35
‑
50g/L的效果。但是，该菌在进行外源引入、过表达和敲除基因的改造后，未对氨基酸和糖代谢流进行精准、合理地调控，一定程度上会影响菌体生长和能量供应，给菌体造成一定的压力，进而影响依克多因的生产；同时该菌未对异源基因簇ectABC优化，在一定程度上限制了依克多因产量的进一步提高。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用，解决技术问题是菌能够有效生产依克多因，并具有较高的产量。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术采用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高效生产依克多因的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌MG1655，编号为ATCC 47076为宿主，其特征在于，A）基于丙酮酸响应转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入PdhR结合位点PdhR Box，使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建得到受丙酮酸调控的Ppr启动子；B）外源引入T7RNAP，在PxylF下表达；C）外源引入密码子优化的ectABC基因簇，一个拷贝在T7启动子下，另一个拷贝在构建的受丙酮酸调控的强启动子Ppr启动子下；在Ppr控制下增量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和天冬氨酸激酶基因lysC；D）通过反义转录抑制thrA和lysA的表达，减少苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸代谢支路的流量并减少其反馈抑制；通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累；通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6
‑
磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量；所述密码子优化的ectABC基因簇将原始外源基因ectABC基因簇序列通过成型的规则修改部分密码子，使其适合大肠杆菌表达的方法，最终人工合成出密码子的DNA片段ectOPT。2.如权利要求1所述一株高效生产依克多因的基因工程菌，其特征在于，所述密码子优化的ectABC基因簇为ectOPT，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示；所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；所述T7终止子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示；所述PxylF基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示；所述RNAP基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示；所述thrA基因的GeneID为945803，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.11所示；所述lysA基因的GeneID为947313，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.12所示；所述iclR基因的GeneID为948524，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.13所示；所述zwf基因的GeneID为946370，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.14所示；所述ppc基因的GeneID为948457，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.15所示；所述lysC基因的GeneID为948531，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.16所示；所述pdhR基因的GeneID为 944827，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.17所示；所述Ppr启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.18所示。3.如权利要求1所述一株高效生产依克多因的基因工程菌的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：a)基于转录因子PdhR，在T7启动子的下游通过融合PCR的方法插入丙酮酸响应转录因子PdhR结合位点PdhR Box（ATTGGTATGACCAAT），使其转录受到丙酮酸响应转录因子PdhR抑制，利用试剂盒ClonExpress通过无缝克隆的方法构建带Ppr启动子的质粒pPRZ，从而获得受丙酮酸调控的Ppr启动子;b)在基因lacZ位点上，通过Cre/loxP技术插入PxylF下表达的T7 RNA聚合酶基因T7RNAP；c)对伸长盐单胞菌（Halomonas elongata DSM 2581）的ectA、ectB、ectC基因（编码蛋
白的GenBank ID：CBV42472、CBV42473、CBV42474）进行密码子优化后分别合成得到基因簇片段ectOPT，在假基因lfhA位点上，通过Cre/loxP技术引入密码子优化后的外源基因ectOPT并在T7启动子下表达；在假基因ycgH位点上，通过Cre/loxP技术外源引入密码子优化后的第二个拷贝的外源基因ectOPT并在Ppr启动子下表达；d)在假基因yneO位点上，通过Cre/loxP技术引入在P
pr
控制下的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，实现ppc基因受控的增量表达；在假基因ilvG位点上，通过Cre/loxP技术引入在P
pr
控制下的天冬氨酸激酶基因lysC，实现lysC基因受控增量表达；e)通过反义转录抑制thrA和lysA的表达，减少苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸代谢支路的流量并减少其反馈抑制。通过反义转录抑制iclR基因的表达，激活乙醛酸途径，提高重要的前体草酰乙酸的积累。通过反义转录抑制zwf基因的表达，减少6
‑
磷酸葡萄糖到HMP途径的代谢流量；所述密码子优化的ectABC基因簇将原始外源基因ectABC基因簇序列通过成型的规则修改部分密码子，使其适合大肠杆菌表达的方法，最终人工合成出密码子的DNA片段ectOPT。4.如权利要求3所述一株高效生产依克多因的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述密码子优化的ectABC基因簇为ectOPT，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示。5.所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；所述T7终止子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示；所述lacZ基因的GeneID为945006，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4所示；所述PxylF基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示；所述RNAP基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示；所述lfhA基因的GeneID为944908，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.7所示；所述ycgH基因的GeneID为2847703，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.8所示；所述yneO基因的GeneID为7751623，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.9所示；所述ilvG基因的GeneID为948279，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.10所示；所述thrA基因的GeneID为945803，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.11所示；所述lysA基因的GeneID为947313，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.12所示；所述iclR基因的GeneID为948524，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.13所示；所述zwf基因的GeneID为946370，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.14所示；所述ppc基因的GeneID为948457，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.15所示；所述lysC基因的GeneID为948531，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.16所示；所述pdhR基因的GeneID为 944827...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊传波，杜敬彩，刘瑞艳，严立恩，陆敏，
申请(专利权)人：山东昆达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：