共价多特异性抗体制造技术

本发明专利技术涉及双特异性工程化抗体和三特异性工程化抗体，其具有位于VH和VL之间的二硫键，并且VL和VH分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的。本发明专利技术的双特异性工程化抗体和三特异性工程化抗体具有较高的稳定性并且其表现出对靶细胞的杀伤作用以及对肿瘤生长的显著抑制作用。胞的杀伤作用以及对肿瘤生长的显著抑制作用。胞的杀伤作用以及对肿瘤生长的显著抑制作用。

【技术实现步骤摘要】
共价多特异性抗体
[0001]本申请是申请号为201910535703.7、申请日为2019年6月20日、专利技术名称为“共价多特异性抗体”的中国专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及具有较高的稳定性的新型共价多特异性抗体及其治疗用途。

技术介绍

[0003]单克隆抗体(mAb)在针对癌症和其他疾病的临床实际应用方面具有广泛的诊断和治疗潜力。无论是以裸抗体的形式还是以与细胞毒性剂(例如，放射性同位素，药物，毒素或前药转化酶)结合的偶联物的形式，单克隆抗体均在癌症免疫疗法中发挥重要作用。这些方法均处于疗效评估过程中，具有不同程度的发展并获得不同程度的临床成功。裸mAb可通过在与癌细胞上过表达的细胞表面蛋白结合之后诱导细胞毒性作用而实现临床反应。已有研究表明，通过经由程序性细胞死亡(凋亡)来控制肿瘤生长或通过诱导抗肿瘤免疫反应来实现这些治疗作用。
[0004]由于抗体的特异性靶向并介导效应子功能这一独特性质，自1975年Cesar Milstein和Georges J.F.Kohler的单克隆抗体技术的专利技术以来，已研发出用作针对疾病的靶向免疫疗法的抗体药物。目前已有超过60个被批准的基于抗体的生物药物，其全球年销售额超过50亿美元。当代抗体药物的成功应用已形成了药物产业并使得公共健康得到了很大改善。除了针对新型靶点的抗体药物的研发之外，最优的联合疗法和创新性的双特异性抗体的研发也有着广阔的前景。
[0005]治疗性抗体已在临床应用超过20年。目前，临床使用的抗肿瘤抗体药物包括：美罗华(Rituxan(1997)),赫赛汀(Herceptin(1998)),Mylotarg(2000),Campath(2001),Zevalin(2002),Bexxer(2003),阿瓦斯汀(Avastin(2004)),爱必妥(Erbitux(2004)),Vectibix(2006)；Arzerra(2009)；Benlysta(2011)；Yervoy(2011)；Adcetris(2011)；Perjeta(2012)；Kadcyla(2013),Opdivo(2014),Keytruda(2014),Tecentriq(2016)。这些抗体主要靶向EGFR,Her2，CD20或VEGF，以及最近发现的PD1或PD
‑
L1。
[0006]多功能抗体是基于传统抗体通过复杂的设计和分子工程而构建的，其具有多抗原结合能力。从实际应用方面来说，单个多功能抗体分子所产生的治疗效果与若干个传统抗体的组合所产生的治疗效果相同。然而，多功能抗体的优势远超过了若干个传统抗体的简单叠加。通过新的且独一无二的机理，所选择的多个靶点的同时接合可产生优于传统抗体的有益作用。例如，靶向CD3和CD19的博纳吐单抗(Blinatumomab，CD3 x CD19，Amgen)在杀伤表达CD19的肿瘤细胞方面可通过其CD3
‑
识别Fv而有效接合T细胞，其在ALL(急性淋巴性白血病)等适应症上展现出了超越传统抗体的显著疗效。博纳吐单抗已于2014年被美国FDA批准上市用于治疗ALL。
[0007]双特异性抗体通过化学交联、杂交
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杂交瘤或转染瘤，或在两个不同的Fab
’
的铰链处进行二硫化物的交换而产生。第一种方法生成异源性且难以界定的产品。第二种方法需
要对由多种杂交抗体副产物得到的双特异性抗体进行大量纯化，该纯化步骤可能会影响细胞交联活性。二硫化物交换方法实质上仅仅应用于F(ab
’
)2并且因此受到单克隆抗体易受到酶消化裂解的影响的限制。而且，因为Fab
’
彼此几乎没有亲和性，所以，形成Fab
’
间二硫键需要非常高的蛋白质浓度。二硫化物交换方法已通过使用Ellman试剂进行了改良，以在氧化前采用Fab
’
中的一个修饰另一个，这样，降低了同源二聚化的发生。然而，即便进行了这样的改良，在高于50％的产率中，异二聚F(ab
’
)2也鲜有产生。然而，不利的安全问题，低反应速度和有限的有效性是目前抗体药物的现状。这些不利因素可能来自于由于抗体的表位来自自身抗原而产生的对正常组织/细胞的非靶效应，免疫效应子细胞的抑制性微环境，未预料到的Fc介导的效应子功能，等等。因此，本领域仍然需要具有良好治疗效用的高纯度多特异性(例如，三特异性)抗体。

技术实现思路

[0008]一方面，本专利技术提供一种工程化抗体，其包含：
[0009](i)第一多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
[0010](ii)第二多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2
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CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；
[0011](iii)第三多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2
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CH3结构域，
[0012]其中：
[0013]VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域，所述第一靶点是CD3；
[0014]VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域，所述第二靶点是CD19；
[0015]VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；
[0016]所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。
[0017]在上文所述的抗体中，VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.:1，VH1的氨基酸序列为SEQ ID NO.:2，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.:3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.:4。所述第一多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.:5，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.:6，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.:7。
[0018]另一方面，本专利技术还提供一种工程化抗体，其包含：
[0019](i)第一多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
[0020](ii)第二多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程化抗体，其包含：(i)第一多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；(ii)第二多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2
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CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；(iii)第三多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2
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CH3结构域，其中：VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域，所述第一靶点是CD3；VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域，所述第二靶点是CD19；VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。2.如权利要求1所述的抗体，其中，VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.:1，VH1的氨基酸序列为SEQ ID NO.:2，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.:3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.:4。3.如权利要求1所述的抗体，其中，所述第一多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.:5，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.:6，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.:7。4.一种工程化抗体，其包含：(i)第一多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；(ii)第二多肽，其在N
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末端至C
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末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2
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CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；(iii)第三多肽，其在N
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末端至C
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【专利技术属性】
技术研发人员：周桢昊，张洁，王晓庆，
申请(专利权)人：浙江博锐生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：