一种氨基酸鉴定和含量测定的方法技术

本发明专利技术公开了一种氨基酸鉴定和含量测定的方法，采用1H

【技术实现步骤摘要】
一种氨基酸鉴定和含量测定的方法


[0001]本专利技术属于氨基酸检测领域，涉及一种氨基酸鉴定和含量测定的方法，更具体地，涉及一种基于核磁共振氢谱技术检测多种氨基酸的方法。

技术介绍

[0002]生物制药领域的上游工艺涉及多种不同类别的细胞与微生物培养过程。其中，氨基酸作为细胞生长所需的关键底物与主要的代谢物，广泛存在于不同类型细胞与微生物的培养液中。通过对细胞培养底物、过程的监测，监测培养液中的氨基酸变化可用于了解培养基的消耗情况与细胞的生长情况，有助于生物药生产过程控制水平的提升。其中，定量监测氨基酸在培养体系中的含量水平便于操作人员及时添加补料或者进入下一阶段生产；检测培养基及培养补料中各关键氨基酸的含量便于操作人员确定每批投料量与补料量、保证过程中关键氨基酸的含量一致性。
[0003]常用的氨基酸检测方法有茚三酮比色法，高效液相色谱方法，全自动氨基酸分析仪检测等方法。CN109374607A号专利公开了一种茶饮料中总游离氨基酸含量测定的方法，该方法通过溶液与茚三酮显色剂显色后测定吸光度计算含量，只能得出混合物中总氨基酸的含量。由于氨基酸大多不具有显色基团，使用高效液相色谱法测定氨基酸含量时，多数需要进行衍生化处理，仪器分析过程的耗时也较久；相较高效液相色谱，基于超高效液相色谱仪的混合氨基酸含量测定方法可缩短样品的仪器分析时间，如CN112730723B号专利所述的22种常见氨基酸检测方法中样品的仪器分析过程耗时14分钟，但在进液相分析前需要将样品经过甲酸甲醇和乙酸乙酯萃取后并氮气吹干、复溶；如CN113125579A号专利所述的氨基酸检测方法中样品的仪器分析过程耗时12分钟，但也需对样品进行复杂的衍生化反应，通过衍生剂6
‑
氨基喹啉基
‑
N
‑
强基琥珀酰亚氨基甲酸酯对样品进行衍生化与加热反应，前述专利的前处理过程均十分复杂，耗时久，消耗较多有机试剂，不够绿色、环保，部分衍生试剂还具有毒性。除液相色谱外，CN109342627B公开了一种通过毛细管电泳的细胞培养物中氨基酸检测方法，该法应用时需要将细胞培养液稀释100
‑
200倍，此外还需要配制相应的氨基酸单体或混合物的标准溶液以获取标准曲线。全自动氨基酸分析仪因为自带衍生系统，相对简化了样品处理过程，但是该方法的测定时间相对较长，如CN101509913B号专利公开的使用氨基酸分析仪测定乳制品中的氨基酸方法中，氨基酸分析仪程序时间长达55min。上述方法中，对于混合体系中的多种氨基酸检测，或多或少都存在一定的局限性，或是前处理过程复杂、或是分析过程耗时久、或是需要大量氨基酸标准品制作随行标曲，因此开发一种通用的、具有广泛适应性的氨基酸分析方法至关重要。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中氨基酸检测方法前处理复杂，检测时间长，标准曲线配置麻烦等问题，本专利技术公开了一种氨基酸鉴定和含量测定的方法，包括以下步骤：
[0005]步骤1)：将标准氨基酸与包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶
液混合，进行核磁共振1H
‑
NMR信号采集，得到第一1H
‑
NMR图谱；
[0006]步骤2)：将待测样品与包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液混合，进行核磁共振1H
‑
NMR信号采集，得到第二1H
‑
NMR图谱；
[0007]步骤3)：将步骤1)得到的所述第一1H
‑
NMR图谱与步骤2)得到的所述第二1H
‑
NMR图谱进行叠加比较分析，通过比对所述第二1H
‑
NMR图谱与所述第一1H
‑
NMR图谱中相对应的各个标准氨基酸的1H
‑
NMR化学位移信号鉴别出所述待测样品中的各个氨基酸；
[0008]步骤4)：对所述第二1H
‑
NMR图谱中氨基酸的信号峰和3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐的信号峰进行积分，根据公式I计算所述待测样品中氨基酸的浓度；其中，公式I如下所示：
[0009][0010]其中，C
x
和C
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的质量浓度和内标的质量浓度；S
x
和S
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的特征峰面积和内标的特征峰面积；n
x
和n
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的特征峰质子数和内标的特征峰质子数；M
x
和M
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的相对分子量和内标的相对分子量；其中所述内标是：3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐。
[0011]在一些实施方案中，所述待测样品为细胞培养基和/或细胞培养液。在一些实施方案中，所述待测样品为细胞培养基和/或细胞的培养液。优选地，所述细胞培养基为干粉培养基或液体培养基。
[0012]在一些实施方案中，所述细胞为CHO细胞、BHK细胞和/或HEK293细胞。在一些具体实施方案中，所述细胞培养液包括但不限于CHO细胞、BHK细胞、HEK293细胞等生物制药领域常用细胞的培养液。
[0013]在一些实施方案中，所述的氘代试剂为氘代水。
[0014]在一些实施方案中，所述内标，3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐(简称TSP)，在氘代水中的浓度为0.2mg/mL
‑
0.7mg/mL。优选为0.5mg/mL。
[0015]在一些实施方案中，待测样品为粉末或溶液形式。
[0016]在一些实施方案中，所述待测样品与所述包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液的体积比为(5
‑
10):1。优选地，所述待测样品与所述包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液的体积比为9:1。
[0017]在一些实施方案中，如前任一项所述的氨基酸鉴定和含量测定的方法，其中所述的步骤1)为如下步骤：
[0018]将标准氨基酸与包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液混合，使用缓冲液调节混合液的pH为6.5
‑
7.5，然后进行核磁共振1H
‑
NMR信号采集，得到第一1H
‑
NMR图谱。
[0019]在一些实施方案中，所述步骤1)具体为：
[0020]将标准氨基酸与所述包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液混合，使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸鉴定和含量测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：将标准氨基酸与包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液混合，进行核磁共振1H
‑
NMR信号采集，得到第一1H
‑
NMR图谱；步骤2)：将待测样品与包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液混合，进行核磁共振1H
‑
NMR信号采集，得到第二1H
‑
NMR图谱；步骤3)：将步骤1)得到的所述第一1H
‑
NMR图谱与步骤2)得到的所述第二1H
‑
NMR图谱进行叠加比较分析，通过比对所述第二1H
‑
NMR图谱与所述第一1H
‑
NMR图谱中相对应的各个标准氨基酸的1H
‑
NMR化学位移信号鉴别出所述待测样品中的各个氨基酸；步骤4)：对所述第二1H
‑
NMR图谱中氨基酸的信号峰和3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐的信号峰进行积分，根据公式I计算所述待测样品中氨基酸的浓度；其中，公式I如下所示：其中，C
x
和C
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的质量浓度和内标的质量浓度；S
x
和S
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的特征峰面积和内标的特征峰面积；n
x
和n
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的特征峰质子数和内标的特征峰质子数；M
x
和M
R
分别是所述待测样品中所含氨基酸的相对分子量和内标的相对分子量；其中所述内标是3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐。2.如权利要求1所述的氨基酸鉴定和含量测定的方法，其中所述待测样品为细胞培养基和/或细胞的培养液；优选地，所述细胞培养基为干粉培养基或液体培养基；所述细胞为CHO细胞、BHK细胞和/或HEK293细胞。3.如权利要求1所述的氨基酸鉴定和含量测定的方法，其中所述的氘代试剂为氘代水。4.如权利要求3所述的氨基酸鉴定和含量测定的方法，其中所述内标在氘代水中的浓度为0.2mg/mL
‑
0.7mg/mL；优选为0.5mg/mL。5.如权利要求4所述的氨基酸鉴定和含量测定的方法，其中所述待测样品与所述包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液的体积比为(5
‑
10):1；优选为9:1。6.如权利要求1所述的氨基酸鉴定和含量测定的方法，其中所述步骤1)具体为：将标准氨基酸与所述包含3
‑
(三甲基甲硅烷基)丙酸
‑
d4钠盐和氘代试剂的溶液混合，使用缓冲液调节混合液的pH为6.5
‑
7.5，然后进行核磁共振...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵芳，万宇翔，焦静雨，高栋，王海彬，许玉明，
申请(专利权)人：浙江博锐生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：