一种催化花椒毒酚生成花椒毒素的O-甲基转移酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种来源于蛇床的O

【技术实现步骤摘要】
一种催化花椒毒酚生成花椒毒素的O
‑
甲基转移酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种催化香豆素类化合物如花椒毒酚生成花椒毒素的O
‑
甲基转移酶及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]蛇床子是传统药用植物蛇床（Cnidium monnieri）的干燥成熟果实。传统医学认为，蛇床子具有燥湿祛风、杀虫止痒、温肾壮阳的功效。蛇床子的化学成分包括蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素等天然产物，花椒毒素作为天然的呋喃香豆素类化合物，具有抗炎抗氧化等多种药理作用，应用前景广泛。花椒毒酚可经甲基化生成花椒毒素，而来源于蛇床的可催化花椒毒酚生成花椒毒素的氧甲基转移酶尚未报道。因此，本领域迫切需要开发一种可以提高目标成分含量或直接生产有效成分的克隆相关酶。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的就是提供一种催化花椒毒酚生成花椒毒素的O
‑
甲基转移酶即CmOMT2蛋白及其编码基因与应用。
[0004]本专利技术的第一方面提供一种分离的CmOMT2多肽，所述多肽选自下组：(a) 具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；(b) 由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基较佳地，1
‑
50个，更佳地，1
‑
30个，更佳地，1
‑
10个，最佳地，1
‑
6个的取代、缺失或添加而形成的且具有催化花椒毒酚活性的衍生蛋白；(c) 序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的衍生蛋白；(d) 氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的同源性≥65%(较佳地≥80%，更佳地≥90％，例如≥95％，≥99％)，并具有催化花椒毒酚活性的衍生蛋白。
[0005]在另一优选实施方式中，所述的序列(c)为由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
[0006]在另一优选实施方式中，所述CmOMT2多肽来自蛇床。
[0007]在一个优选实施方式中，所述CmOMT2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组：(a)编码如SEQ ID NO:1所示CmOMT2多肽的核苷酸序列；(b)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(c) 与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥75%(较佳地≥80%，更佳地≥90％，例如≥95％，≥99％)的核苷酸序列；(d) 在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的5
’
端和/或3
’
端截短或添加1
‑
60个(较佳地1
‑
30，更佳地1
‑
10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；(e) 与(a)
‑
(d)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。
[0009]在优选实施方式中，所述的核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]在另一优选实施方式中，序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽。
[0011]本专利技术第三方面提供了一种重组载体，它含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。
[0012]在一些实施方式中，所述载体选自下组：表达载体、穿梭载体、整合载体、或其组合。
[0013]在另一些实施方式中，所述载体选自下组：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒、或其组合。
[0014]在优选实施方式中，所述载体包括在大肠杆菌中表达的载体，如pET系列载体。
[0015]本专利技术第四方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的重组载体，或其基因组中整合本专利技术第二方面所述的多核苷酸。
[0016]在另一优选实施方式中，所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。更优选地，所述宿主细胞选自下组：细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述的宿主细胞为低等真核细胞，如酵母细胞。在另一些实施方式中，所述宿主细胞为高等真核细胞，如哺乳动物细胞。在另一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞，如细菌细胞，较佳地，大肠杆菌。
[0017]本专利技术第五方面提供了一种CmOMT2多肽的制备方法，所述方法包括：(a)在适合表达的条件下，培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述CmOMT2多肽。
[0018]本专利技术第六方面提供了一种如本专利技术第一方面所述的CmOMT2多肽或其衍生多肽、本专利技术第三方面所述的载体、或本专利技术第四方面所述的宿主细胞的用途，它被用于催化以下反应，或被用于制备催化以下反应的催化制剂：将香豆素类化合物的羟基进行甲基化反应得到相应的产物,例如催化花椒毒酚的8位羟基发生甲基化反应，生成花椒毒素。
[0019]本专利技术第七方面提供了一种cf 香豆素类化合物的羟基进行甲基化反应方法，包括如下步骤：在本专利技术第一方面所述的多肽或其衍生多肽的存在下，催化香豆素类化合物的羟基进行甲基化反应得到相应的产物。更具体地是，催化花椒毒酚从而得到花椒毒素（因而也就是花椒毒素的制备方法）；反应原理如下式：在另一优选实施方式中，所述的方法还包括将所述的多肽及其衍生多肽分别加入催化反应；和/或将所述的多肽及其衍生多肽同时加入催化反应。
[0020]在进一步优选实施方式中，所述方法还包括：向反应体系中提供用于调节酶活性的添加物。
[0021]在另一些实施方式中，所述的用于调节酶活性的添加物是：提高酶活性或抑制酶活性的添加物。在另一优选实施方式中，所述的用于调节酶活性的添加物选自下组：Mg
2+
、
Ca
2+
、Co
2+
、Mn
2+
、Ba
2+
、Al
3+
、Ni
2+
、Zn
2+
、或Fe
2+
。
[0022]在优选实施方式中，反应体系的pH为：6.5
‑
8.5，优选pH为7.4
‑
7.6。
[0023]在另一些优选实施方式中，反应体系的温度为：25 ℃
‑
35 ℃，优选28 ℃
‑
30 ℃。
[0024]在另一些优选实施方式中，反应体系的时间为0.5 h
‑
24 h，较佳地，1 h
‑
10 h，更佳地，2 h
‑
3 h。
[0025]本专利技术还提供所述的O
‑
甲基转移酶、所述的重组载体、所述的重组宿主细胞的用途，其用于催化以下反应，或被用于制备催化以下反应的催化制剂：对香豆素类化合物的羟基进行甲基化反应，例如将花椒毒酚或其结构类似物的羟基进行甲基化反应，生成花椒毒素或其结构类似物。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的O
‑
甲基转移酶，其特征在于，所述多肽选自下组任意之一：a) 具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；b) 由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基，较佳地，1
‑
50个，更佳地，1
‑
30个，更佳地，1
‑
10个，最佳地，1
‑
6个的取代、缺失或添加而形成的且具有催化花椒毒酚活性的衍生蛋白；c) 序列中含有a)或b)中所述蛋白序列的衍生蛋白，例如添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白；d) 氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的同源性≥65%，较佳地≥80%，更佳地≥90％，例如≥95％，≥99％，并具有催化花椒毒酚活性的衍生蛋白。2.如权利要求1所述的O
‑
甲基转移酶，其特征在于，来自蛇床。3.一种分离的核酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组任意之一：a)编码如SEQ ID NO:1所示CmOMT2多肽的核酸；b)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；c) 与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥75%，较佳地≥80%，更佳地≥90％，例如≥95％，≥99％的核酸；d) 在SEQ ID NO:2所示核酸序列的5
’
端和/或3
’
端截短或添加1
‑
60个，较佳地1
‑
30，更佳地1
‑
12个，更佳的1
‑
9个核苷酸所形成的核酸；e) 与a)
‑
d)任一所述的核酸序列互补的核酸。4.一种重组载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的核酸，优选地，出发载体是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒。5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合权利要求3所述的核酸；优选地，其是细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞，更优选为酿酒酵母、大肠杆菌。6.一种O
‑
甲基转移酶的制备方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，张琰琛，白朋纲，庄以彬，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：