大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量ＰＣＲ检测方法技术

本发明专利技术提供一种大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量ＰＣＲ检测方法，根据大口黑鲈溃疡综合症病毒ＤＮＡ甲基转移酶３’端非编码区序列，设计并合成引物，预期扩增１６７ｂｐ片段：上游引物ＰＦ：５’－ＧＣＴＣＧＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣ－３’，下游引物ＰＲ：５’－ＧＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣ－３’；同时合成探针ＰＢ：５’－（ＦＡＭ）ＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＡＧ（Ｅｃｌ?ｉｐｓｅ）－３’用以荧光检测。再经提取模板ＤＮＡ、ＰＣＲ扩增反应，根据检测到的ＣＴ值判断样品中的病毒粒子含量，具有检测速度快、检测精度高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及对大口黑鲈溃疡综合症虹彩病毒特异的检测方法。
技术介绍
大口黑鲈(Micropterus salmoides)，又名加州鲈，具有生长快、病害少、耐低温、 肉质鲜美和容易起捕等特点，从上世纪七十年代开始推广到世界各地，目前全国大口黑鲈 的年产量在10万吨左右。自从2006年以后，每年6-10月期间，一种溃疡综合症在广东省 的养殖大口黑鲈中流行，而且有逐年加重的趋势。感染该病毒的鱼发病时皮肤和肌肉溃烂， 脾脏和肾脏变大，病鱼死亡率最高达60 %，给养殖者造成了巨大的损失，已对大口黑鲈养殖 产业构成了严重威胁。2008年，本单位的科研人员从病鱼中成功分离到一种病毒，经回归感 染确认该病毒就是导致溃疡病的病原，经过电镜观察和DNA序列分析，确定了该病毒的分 类地位是虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)，命名为大口黑鲈溃疡综合症 病毒。由于该病毒是新发现的病毒，对这种病毒病还没有有效的治疗方法，所以对该病的早 期快速诊断，确定病原成为重要的防治手段，以减少生产上的损失。水生病毒检测方法有生物学测定法、凝集试验、透射电镜观察法、酶联免疫反应、 免疫组织化学、PCR检测等方法。生物学方法比较灵敏，但要花费2-3周的时间，不适合作 病毒的快速检测与鉴定；凝集试验快速简便，但敏感性较差，应用不广；透射电镜观察法需 要透射电镜设备，费时、费力，成本很高；酶联免疫反应检测快速，但需要有效的特异的抗 体；免疫组织化学耗时，步骤繁琐，也需要有特异的抗体；PCR检测法具有特异、敏感、高效、 快速、简便、重复性好和易自动化操作等突出的优点，已广泛应用于致病病毒的检测；荧光 定量PCR方法是在PCR方法基础上进行改进了的又一种病毒检测方法，其优点在于灵敏度 比普通PCR方法更高，且省去了电泳的步骤，节省了时间，提高了检测的效率。大口黑鲈溃 疡综合症病毒是新近发现、分离并鉴定的病毒，在分类地位上属于虹彩病毒科蛙病毒属，我 们克隆并确定了该病毒的DNA甲基转移酶基因及其两端侧翼碱基序列，GenBank登陆号为 ⑶256634。1999年，Mao等人根据脊椎动物虹彩病毒主要依壳蛋白基因和DNA甲基转移酶基 因的保守序列设计并合成引物，利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 的方法有效地鉴定出虹彩病毒科蛙病毒属的病毒，但利用这个方法不能将大口黑鲈溃疡综 合症病毒与蛙病毒属的其它病毒株进行区分。
技术实现思路
本专利技术的目的正是针对现有技术存在的技术缺陷，根据大口黑鲈溃疡综合症病毒 DNA甲基转移酶基因3’端序列设计特异性PCR扩增引物，建立一种快速、准确、灵敏的在鱼 发病早期特异性检测大口黑鲈溃疡综合症病毒的荧光实时定量PCR方法，其与普通PCR方 法相比，虽然对设备要求较高、检测成本也较高，但该方法具有灵敏度更高、更加直观、更加 省时省力的优点。为达到上述目的，本专利技术大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法的检测步骤如下(一)、引物的设计根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引 物和探针如下上游引物PF 5，-GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC-3，下游引物PR 5，-GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC-3，探针PB :5，- (FAM) ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG (Eelipse) -3‘ 预期扩增DNA片段167bp ；(二)、提取模板 DNA(1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0. 5mL的裂解液，55°C消化1小时， 其间不时轻轻摇动。(2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混勻，室温下静置5分钟后，12000转/ 分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心 10分钟，取上清液。(3)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。(4)、用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥 10分钟，加入50 u 1TE溶解DNA，4°C贮存备用。(三)、PCR反应体系ddH2018. 8u L10XPCR Buffer2. 5 u L4XdNTP(10mmol/L) 0. 5 u LTaq 酶(5U/iiL)0. 2 u LPF(10umol/L)0. 5 u LPR(10umol/L)0. 5 u LROX 染料0. 5 ii LPB(10umol/L)0. 5 u L模板 DNA1. 0u L检测待测样品的同时，按108、107、106、105、104拷贝数/yL系列稀释的线性化质粒 pMT-rt，各取1 y L作为模板，检测CT值，制作标准曲线，另以1 P L ddH20为模板作阴性对 照。PCR结束后，根据检测到的CT值判断样品中的病毒粒子含量。(四)、PCR反应条件95°C预变性3分钟；再40个循环反应，包括95°C变性15秒，60°C退火和延伸共1 分钟。(五)、判断标准当CT值小于等于33可判断为阳性；当CT值大于等于35可判断为阴性；当CT值在33-35之间为可疑，需重复检测，如果重复检测CT值小于等于33可判 断为阳性，大于33可判断为阴性。4 本专利技术检测法利用生物信息学手段，将大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶 基因3，序列在NCBI数据库中(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)进行BLAST比对，目前已 知的DNA序列中没有与之同源的序列。根据这段特异的序列设计引物和探针，以待检测鱼 的脾脏组织基因组为模板进行荧光定量PCR扩增，检测其是否感染大口黑鲈溃疡综合症病用限制性内切酶EcoR I酶切含有DNA甲基转移酶基因序列的质粒(名称为 pMT-rt) 4 小时，纯化后按 108、107、106、105、104、103、102、101、10° 拷贝数 / P L 系列稀释，各 取1 P L线性化质粒作为模板，以无质粒的水作阴性对照，在荧光定量PCR仪上进行PCR反 应，60°C读板检测建立标准曲线，斜率为3. 55，R2 = 0. 998，呈现很好的线性关系，扩增效率 91% (用E = 10(1/M)-1公式计算)，具有良好的扩增效率。样品检测反应35个循环可以检 测到的质粒最小浓度是101拷贝数/PL。选用107、106、105拷贝数/yL 3个浓度梯度，每 个梯度重复4次，变异系数在0. 32% -1. 6%范围内，说明该方法具有良好的重复性和稳定 性。分别以正常大口黑鲈、感染传染性脾肾坏死病毒的大口黑鲈和感染溃疡综合症病毒的 大口黑鲈的脾脏组织DNA作为模板，进行PCR扩增以检测引物的特异性，结果该方法仅扩增 出大口黑鲈溃疡综合症病毒感染的病鱼组织的PCR产物，而正常大口黑鲈和感染传染性脾 肾坏死病毒的鱼均检测不到扩增产物，说明该方法特异性好，可准确检测出大口黑鲈溃疡 综合症病毒。本专利技术的有益效果是检测速度快，大约可以在3. 5个小时内完成；在检测时设阳 性对照(以含有DNA甲基转移酶基因3’序列的质粒pMT-rt为PCR模板)和阴性对照(以 水为模板)，所以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量ＰＣＲ检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：　　（一）、引物的设计　　根据大口黑鲈溃疡综合症病毒ＤＮＡ甲基转移酶３’端非编码区序列，设计并合成引物和探针如下：　　上游引物ＰＦ：５’－ＧＣＴＣＧＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣ－３’　　下游引物ＰＲ：５’－ＧＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣ－３’　　探针ＰＢ：５’－（ＦＡＭ）ＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＡＧ（Ｅｃｌｉｐｓｅ）－３’　　预期扩增ＤＮＡ片段１６７ｂｐ；　　（二）、提取模板ＤＮＡ　　（１）、取待检测鱼的脾脏组织５０ｍｇ剪碎后，加入０．５ｍＬ的裂解液，５５℃消化１小时，其间不时轻轻摇动；　　（２）、加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，颠倒混匀，室温下静置５分钟后，１２０００转／分钟离心１０分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置５分钟后，１２０００转／分钟离心１０分钟，取上清液；　　（３）、加入２倍体积的无水乙醇，室温静置１０分钟沉淀ＤＮＡ，１２０００转／分钟离心１０分钟；　　（４）、用７０％乙醇洗涤１次，１２０００转／分钟离心２分钟，吸去上清，室温静置干燥１０分钟，加入５０μｌ　ＴＥ溶解ＤＮＡ，４℃贮存备用；　　（三）、ＰＣＲ反应体系　　ｄｄＨ↓［２］Ｏ　１８．８μＬ　　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ　　４×ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）　０．５μＬ　　Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）　０．２μＬ　　ＰＦ（１０μｍｏｌ／Ｌ）　０．５μＬ　　ＰＲ（１０μｍｏｌ／Ｌ）　０．５μＬ　　ＲＯＸ染料　０．５μＬ　　ＰＢ（１０μｍｏｌ／Ｌ）　０．５μＬ　　模板ＤＮＡ　１．０μＬ　　检测待测样品的同时，按１０↑［８］、１０↑［７］、１０↑［６］、１０↑［５］、１０↑［４］拷贝数／μＬ系列稀释的线性化质粒ｐＭＴ－ｒｔ，各取１μＬ作为模板，检测ＣＴ值，制作标准曲线，另以１μＬ　ｄｄＨ↓［２］Ｏ为模板作阴性对照，ＰＣＲ结束后，根据检测到的ＣＴ值判断样品中的病毒粒子含量；　　（四）、ＰＣＲ反应条件　　９５℃预变性３分钟；再４０个循环反应，包括９５℃变性１５秒，６０℃退火和延伸共１分钟；　　（五）、判断标准　　当ＣＴ值小于等于３３可判断为阳性；　　当ＣＴ值大于等于３５判断为阴性；当ＣＴ值在３３－３５之间为可疑，需重复检测，如果重复检测ＣＴ值小于等于３３可判断为阳性，大于３３可判断为阴性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马冬梅，白俊杰，邓国成，李胜杰，叶星，于凌云，陈昆慈，谢俊，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]