一种基于固相载体的单链DNA的合成与扩增方法技术

本发明专利技术提供一种基于固相载体的单链DNA的拼接方法，具体地，本发明专利技术通过将目标单链DNA拆分成n条寡核苷酸链，并以此为模板，经由多次延伸反应，拼接获得固定于所述固相载体的全长单链DNA，进而可用于扩增得到目标单链DNA。由此，本发明专利技术还提供了一种基于固相载体的目标单链DNA的合成方法以及相关试剂盒。本发明专利技术的方法克服了现有的固相和液相合成单链DNA、尤其是长单链DNA的方法中存在的各种缺陷，具有通用性高、操作简便、成本低廉、分离简单等一系列特点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于固相载体的单链DNA的合成与扩增方法


[0001]本专利技术涉及核酸合成领域，具体地，本专利技术涉及单链DNA、尤其是基于固相载体的长单链DNA的合成与扩增方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]单链DNA(ssDNA)是指脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键形成的聚合物，呈链状结构。一般情况下，DNA以双链形式存在，在高温或碱性条件下，双链DNA(dsDNA)变性解链为ssDNA。不同长度的ssDNA有不同的应用，例如，十几个碱基(nt)的ssDNA可用作核酸适配体，20nt左右的ssDNA可用作PCR反应的引物，几十nt的ssDNA可用作基因编辑中的供体DNA，几百nt的ssDNA可用作DNA折纸中的骨架DNA等。ssDNA以其区别于其他生物大分子的某些性质，在多个领域都发挥着举足轻重的作用。
[0003]ssDNA合成方法包括化学合成法和生物合成法，两者都可以做到从头合成。化学合成依赖经典的固相亚磷酰胺三酯法，目前，该方法多用于合成长度小于150nt的序列，其中，长度小于40nt的序列可直接用于下游应用，长度介于41
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150nt的序列经纯化后也可用于下游应用。也就是说，化学合成法可以合成产量满足下游应用的150nt以下的ssDNA。但是，当序列长度超过150nt时，由于化学反应的单步反应效率无法达到100％，随着序列的延长，单步反应效率的累积会造成总反应效率的迅速降低，导致反应终产物中符合要求的全长片段含量极低，无法用于下游应用。
[0004]生物合成法依赖生物酶实现ssDNA的合成，其中不依赖模板的末端转移酶(TdT)可直接实现ssDNA的从头合成，但目前该方法仍处于探索阶段，其单步反应效率尚不及化学合成效率，更无法应用于生产实践，且由于该方法将TdT与反应单体连接后用作反应物，存在严重的试剂浪费。例如，2018年发表的一篇文章(Sebastian Palluk，et al.，De novo DNA synthesis using polymerasenucleotide conjugates，Nature Biotechnology，2018，36(7)：645
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650)称目前可实现基于该酶的10nt长度的ssDNA合成，但该方法并未凸显出生物酶法ssDNA合成效率极高的优势，甚至其合成效率远低于化学合成效率，且该方法中TdT与单体相连用作反应底物，并非催化剂。
[0005]其他的生物酶法需要依赖模板链完成ssDNA的合成或扩增，依据有无固相载体的介入可概括为液相法和固相法两类。液相法包括不对称PCR法、lambda核酸酶降解法、细菌介导的ssDNA的扩增、转录介导的ssDNA的扩增(TMA)、滚环复制(RCA)等，这些方法涉及的反应均在液相中进行，反应效率高、速度快，反应结束后溶液体系以目标ssDNA为主，同时也会存在多余片段、模板链或双链等副产物。固相法包括1988年Thomas Hultman等人提出的磁珠线性扩增法、2000年C
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line Adessi等人提出的桥式PCR法和2003年Devin Dressman等人提出的乳液PCR法等，利用固相载体进行ssDNA扩增的优点在于模板链与目标链极易分离，对后续纯化步骤要求较低。
[0006]总而言之，目前ssDNA的合成与扩增主要存在以下三方面的不足：合成序列较短或无法合成新序列、终产物成分复杂、通用性较低。
[0007]对于长单链DNA(long single strand DNA，lssDNA)的合成与扩增，目前应用较多的技术可以分为两类，即液相扩增和固相扩增，两者均依赖现有模板合成，区别在于反应过程中有无固相载体的引入。多种固液相扩增方法解决了lssDNA合成困难的问题，利用现有方法可以合成长达几千碱基的lssDNA，但是这些方法的使用前提是存在全长模板DNA链。也就是说，现有的固液相扩增虽然可合成较长的ssDNA(例如，长达几千碱基)，但无法做到从头合成新序列。
[0008]液相扩增是一类方法的总称，包括lambda核酸酶降解法、不对称PCR法、链置换法(SDA)、滚环复制法(RCA)、转录介导的ssDNA的扩增(TMA)等一系列方法。Lambda核酸酶法可以通过降解模板链得到目标ssDNA；不对称PCR法扩增后得到多于模板链的目标链；SDA依赖具有链置换功能的DNA聚合酶不断合成新链、置换旧链；RCA以质粒滚环复制的产物是ssDNA为原理扩增得到ssDNA；TMA使用RNA聚合酶和逆转录酶合成DNA
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RNA杂交体，然后降解RNA得到ssDNA。这些方法均需借助存在于溶液中的模板链完成ssDNA的扩增或获取，大多数方法反应灵敏、效率高，并且除了链置换法仅适用于几十碱基的ssDNA的合成与扩增之外，其他均可合成较长的单链DNA，进而可以方便地应用于检测领域。然而，限制于液相扩增的原理，多数扩增反应的终反应体系中存在多种非目标链，例如模板链、双链以及在目标链上额外引入的其他序列等。具体来说，液相反应的终产物成分复杂，例如，lambda核酸酶降解法的反应终产物中可能含有未降解完的模板链或部分降解的目标链；不对称PCR终产物中含有双链DNA；TMA法所得ssDNA会引入启动子序列且实验过程中会用到较贵或不常用的逆转录酶等试剂；RCA法所得ssDNA串联在一起，无法直接用于下游应用。
[0009]相比之下，固相扩增将一条引物固定于固相载体上，可以直接通过固液相分离完成目标ssDNA与模板ssDNA的分离，此为固相扩增相较于液相扩增的优势。固相扩增以磁珠线性扩增法、桥式PCR、乳液PCR等较为常见。在磁珠线性扩增中，模板链通过生物素固定于表面覆盖有亲和素的磁珠上，通过目标链引物的退火、延伸、解离完成目标链的扩增。该方法使用生物素和亲和素之间的亲和力固定模板ssDNA，在反应过程中，模板ssDNA有脱落的可能性。桥式PCR法的目标链与模板链引物均固定于固相载体上，模板游离于溶液，初始反应中，固相载体引物与游离模板退火，完成固相引物的延伸，获得固相模板；后续循环中，固相模板弯曲与相应固相引物退火使固相引物完成延伸，但该方法中，由于首尾引物均连接在固相载体上，反应结束后很难获取特定DNA链。乳液PCR在油包水腔室中进行，每个腔室中包含通过生物素固定在磁珠上的引物和游离于水相中的模板链DNA，在退火、延伸、解链的PCR循环中，固定于磁珠的引物在聚合酶作用下以游离DNA为模板延伸为全长目标链，反应结束后，取出磁珠即可得到附着于其表面的目标ssDNA。固相载体的加入使扩增所得ssDNA可极为方便的与模板链分离，在一定程度上弥补了液相扩增的不足之处。但目前固相扩增方法仍无法从头合成新序列。
[0010]现有的lssDNA的生物合成方法繁多，但多种lssDNA合成与扩增方法存在普适性与通用性不强、灵活性不够等缺点。目前还没有一种lssDNA生物合成方法适用于多种下游应用，实验者需根据实验条件及目的甄选最为合适的lssDNA合成与扩增方法，必要时还需要购买其他试剂以完本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于固相载体的单链DNA的拼接方法，其包括：a)提供拼接反应体系，所述拼接反应体系至少包含：固定有拼接起始引物的固相载体、由目标单链DNA拆分形成的n条寡核苷酸链及DNA聚合酶，其中所述拼接起始引物的游离末端与第1条寡核苷酸链之间存在互补区，且相邻的寡核苷酸链首尾具有重叠片段；b)使所述拼接起始引物与第1条寡核苷酸链退火，并以所述第1条寡核苷酸链为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸；c)经延长的所述拼接起始引物依次与第2至n条寡核苷酸链退火，并依次以所述第2至n条寡核苷酸链为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，最终获得固定于所述固相载体的全长单链DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述拼接起始引物的长度为22
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30nt，优选30nt；优选地，所述互补区的序列长度为18
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23nt，优选为20nt。3.根据权利要求1
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2中任一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸链的长度为60
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80nt，优选62
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79nt；优选地，所述重叠片段的长度为15
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25nt，优选18
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25nt。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中，所述DNA聚合酶为Ex Taq、Q5、或Phusion，优选为Q5。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中，在步骤c)之后，使拼接反应体系升温至95℃至99℃，例如至98℃，以使全长单链DNA与寡核苷酸链解离，然后使所述拼接反应体系降温至0
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4℃，例如至4℃，并任选地然后使用双蒸水(ddH2O)清洗所述固定有全长单链DNA的固相载体。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中，所述全长单链DNA为10nt至500nt，例如为至少15...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，张旭，江湘儿，原超峰，何晨菲，沈玥，章文蔚，徐讯，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：