一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法，包括：将待连接环化的单链核酸和其他组分一次性混合，以形成环化体系；和将所述环化体系置于连接环化条件，以使所述待连接环化的单链核酸连接环化，其中所述核酸为DNA和/或RNA，所述其他组分包括热稳定性DNA连接酶和/或RNA连接酶和可选地反应缓冲液。该方法一次性添加所有组分形成单链核酸的环化体系，能够提高单链核酸的环化连接效率，并应用于自动化环化单链核酸。用于自动化环化单链核酸。

【技术实现步骤摘要】
一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法。

技术介绍

[0002]CircLigase是一种具有热稳定性的单链DNA或RNA连接酶，改造后的CircLigase具有更强的热稳定性，可以不依赖ATP，对具有5
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磷酸基团和3
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羟基基团且长度为15nt以上的单链DNA和RNA有较高的单个单链DNA分子内连接催化活性。然而，相关技术中，CircLigase对于两条单链间的连接催化活性较低，并且在单链DNA连接及环化过程中需要分次加入组分。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的实施例提出一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法，能够一次性添加所有组分形成环化体系以进行单链核酸的自动化连接及环化，减少人工成本，且提高单链连接效率。
[0004]第一方面，本专利技术的实施例提出一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法，包括：将待连接环化的单链核酸和其他组分一次性混合，以形成环化体系；和将所述环化体系置于连接环化条件，以使所述待连接环化的单链核酸连接环化，其中所述核酸为DNA和/或RNA，所述其他组分包括热稳定性DNA连接酶和/或RNA连接酶和可选地反应缓冲液。
[0005]在一些实施例中，所述连接环化为分子间或分子内的连接环化，所述单链DNA的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和3<br/>’‑
羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。
[0006]在一些实施例中，所述其他组分还包括接头，其中：在所述连接环化为分子内的连接环化的情况下，所述接头与同一条所述单链DNA的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对；在所述连接环化为分子间的连接环化的情况下，所述接头分别与两条所述单链DNA中的一者的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和另一者的3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。
[0007]在一些实施例中，所述连接环化条件包括：变性、复性和反应，其中变性温度为70
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80℃，复性温度为0
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70℃，反应温度为55
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70℃。
[0008]在一些实施例中，所述变性持续2
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10分钟，所述复性持续2
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40分钟，并且所述反应持续30
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240分钟。
[0009]在一些实施例中，在所述复性后、进行所述反应前，不进行将所述其他组分添加至所述环化体系的步骤。
[0010]在一些实施例中，所述其他组分中不包括ATP。
[0011]在一些实施例中，所述热稳定性DNA连接酶和/或RNA连接酶为非ATP依赖的CircLigase。
[0012]在一些实施例中，所述单链DNA的长度为50
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1000nt，连接环化产物的长度为50
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1000nt。
[0013]在一些实施例中，所述方法由自动化操作台实现。
[0014]第二方面，本专利技术的实施例提出一种根据第一方面任一实施例在以下中的至少一种中的应用：a.纳米核酸制品的制备；b.分子克隆；和c.疾病诊断。
[0015]在一些实施例中，其中所述纳米核酸制品包括包覆有环状核酸分子的磁珠、核酸纳米球、包含环状核酸分子的纳米线、纳米盒和纳米芯片，其中所述核酸为DNA和/或RNA。
[0016]本专利技术实施例提供的基于单次加样的连接环化单链核酸的方法具有以下有益效果：
[0017](1)能够一次性添加所有组分形成单链核酸的环化体系，能够应用于自动化环化，减少了人工成本。
[0018](2)能够应用于高温催化，提高了单链核酸的环化连接效率。
附图说明
[0019]图1是本专利技术实施例的基于单次加样的连接环化单链核酸的方法示意图；
[0020]图2是本专利技术实施例的分子内环化效率结果图；
[0021]图3是本专利技术另一个实施例的分子内环化效率结果图；
[0022]图4是本专利技术实施例的分子间环化效率结果图。
[0023]标记：
[0024]A:DNA marker；B:ssDNA；C:连接环化产物。
具体实施方式
[0025]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0026]应理解，本专利技术的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
[0027]第一方面，本专利技术的实施例提出一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法，其特征在于，包括：将待连接环化的单链核酸和其他组分一次性混合，以形成环化体系；和将所述环化体系置于连接环化条件，以使所述待连接环化的单链核酸连接环化，其中所述核酸为DNA和/或RNA，所述其他组分包括热稳定性DNA连接酶和/或RNA连接酶和可选地反应缓冲液。
[0028]在一些实施例中，所述连接环化为分子间或分子内的连接环化，所述单链DNA的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。当所述单链DNA的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对时，两个末端的空间距离接近，有利于热稳定性DNA连接酶和/或RNA连接酶发挥催化作用。
[0029]在一些实施例中，所述其他组分还包括接头，其中：在所述连接环化为分子内的连接环化的情况下，所述接头与同一条所述单链DNA的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对；在所述连接环化为分子间的连接环化的情况下，所
述接头分别与两条所述单链DNA中的一者的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和另一者的3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。
[0030]在一些实施例中，所述连接环化条件包括：变性、复性和反应，其中变性温度为70
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80℃，复性温度为0
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70℃，反应温度为55
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70℃。
[0031]在一些实施例中，所述连接环化条件包括：变性、复性和反应，其中变性温度为70℃，复性温度为室温25℃，反应温度为65℃。
[0032]在一些实施例中，所述变性持续2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法，其特征在于，包括：将待连接环化的单链核酸和其他组分一次性混合，以形成环化体系；和将所述环化体系置于连接环化条件，以使所述待连接环化的单链核酸连接环化，其中所述核酸为DNA和/或RNA，所述其他组分包括热稳定性DNA连接酶和/或RNA连接酶和可选地反应缓冲液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接环化为分子间或分子内的连接环化，所述单链DNA的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述其他组分还包括接头，其中：在所述连接环化为分子内的连接环化的情况下，所述接头与同一条所述单链DNA的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对；在所述连接环化为分子间的连接环化的情况下，所述接头分别与两条所述单链DNA中的一者的5
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磷酸基团末端的核苷酸序列和另一者的3
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羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接环化条件包括：变性、复性和反应，其中变性温度为70
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【专利技术属性】
技术研发人员：蔡梦，
申请(专利权)人：杭州纳博智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：