dsRNA的制备方法及其在制备dsRNA标准品中的应用技术

本发明专利技术提供了一种dsRNA的制备方法及其在制备dsRNA标准品中的应用，涉及生物技术领域。该dsRNA的制备方法包括先经体外转录合成ssRNA，再将反应产物中的体外转录模板降解为单个核苷酸；然后退火形成dsRNA，再使用S1核酸酶降解退火产物中的单链核酸，纯化反应产物得到dsRNA。该制备方法缓解了现有技术中缺少一种制备高纯度dsRNA方法的问题。种制备高纯度dsRNA方法的问题。种制备高纯度dsRNA方法的问题。

【技术实现步骤摘要】
dsRNA的制备方法及其在制备dsRNA标准品中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种dsRNA的制备方法及其在制备dsRNA标准品中的应用。

技术介绍

[0002]mRNA疫苗是一种利用信使RNA(mRNA)的分子副本来产生免疫反应的疫苗。此类疫苗将编码抗原的mRNA分子送入免疫细胞，免疫细胞使用设计好的mRNA作为模板来构建通常由病原体(如病毒)或癌细胞产生的外来蛋白质。这些蛋白质分子刺激适应性免疫反应，教导身体识别并摧毁相应的病原体或癌细胞。mRNA疫苗是由脂质纳米颗粒及封装在其中的RNA共同组成，保护RNA链并帮助其吸收进入细胞。因新冠疫情，在疗效、研发速度周期、成本价格、生产的可拓展性和安全性等方面有显著优势的mRNA疫苗技术路线开始备受关注。
[0003]mRNA原液的制备和转录是疫苗生产的关键步骤，mRNA的质量直接决定了疫苗的临床表现。dsRNA的全称是double
‑
stranded RNA，译为双链核糖核酸。在IVT(mRNA体外合成)的过程中，T7 RNA聚合酶可能以RNA或DNA(模板链与非模板链)为模板进行转录，形成不同类型的dsRNA副产物。对mRNA疫苗与mRNA治疗药物而言，在制备过程中所产生的dsRNA副产物不仅会降低疫苗与药物的效力，还会引发不良的免疫反应，因此确保产物中无dsRNA不纯物的存在，是mRNA生物制剂品质管控中极为重要的一环。
[0004]dsRNA检测方法包括dot blot(免疫斑点)、ELISA(酶联免疫吸附实验)、HTRF(均相时间分辨荧光)和HPLC。除了HPLC，其它方法检测过程中均需dsRNA标准品，像美国药典中陈述的用dot blot法检测dsRNA含量的过程，首先将dsRNA标准品和待检mRNA样品滴在尼龙膜上，干燥、封闭后，加入检测抗体J2，孵育1hr后，洗去未结合检抗，再加入酶标二抗，同样孵育1hr后，洗去未结合酶标二抗，加入底物反应显色，通过mRNA样品与dsRNA标准品显色信号的比对来计算mRNA样品中dsRNA的含量。ELISA和HTRF中也都需要用标准品来绘制标准曲线。
[0005]目前，市场上并没有dsRNA标准品在售，需要研发人员自行制备。dsRNA的制备通常通过两条ssRNA(单链RNA)互补配对形成，而ssRNA的合成既可通过化学合成也可通过T7启动子介导的体外转录反应，化学合成ssRNA长度受限，一般不超过160nt，且价格昂贵；T7体外转录反应不受长度限制，制备大量ssRNA，成本也显著低于化学合成，因此更适合用于工业生产。目前，均有基于T7体外转录反应制备dsRNA的文献和产品报道，这些方案的基本思路是一致的：PCR获得转录模板
→
体外转录
→
退火形成双链
→
DNA酶和RNA酶处理
→
醇沉淀
→
重悬、定量。
[0006]目前市售的用于dsRNA制备的商用试剂盒，例如Promega T7RiboMAX
TM Express RNAi kit和Thermo Scientific MEGAscript RNAi kit，在其说明书中，均有制备成品dsRNA的琼脂糖凝胶电泳结果展示(图5和图6)，根据电泳结果，两个商用试剂盒制备所得的dsRNA产物条带都不够单一：Promega T7 RiboMAX
TM Express RNAi kit制备的三种大小dsRNA均有明显杂带，Thermo Scientific MEGAscript RNAi kit阳性对照反应经过最后纯
化步骤所得的产物中也依然有约1kb的杂带。且两个产品都没有分辨率更高的分析工具(如毛细管电泳，CE)对dsRNA产物纯度的进一步分析与鉴定。因此，如何提高dsRNA标准品的纯度是目前有待解决的问题。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种dsRNA的制备方法，以缓解现有技术中存在的缺少一种制备高纯度dsRNA方法的问题。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种上述dsRNA的制备方法在制备dsRNA标准品、制备mRNA疫苗以及制备mRNA疫苗质控产品中的应用。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0011]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种dsRNA的制备方法，包括先经体外转录合成ssRNA，再将反应产物中的体外转录模板降解为单个核苷酸；然后退火形成dsRNA，再使用S1核酸酶降解退火产物中的单链核酸，纯化反应产物得到dsRNA。
[0012]优选地，所述体外转录产物由T7 RNA聚合酶催化反应得到；
[0013]优选地，所述体外转录产物的转录模板两端含有T7 RNA聚合酶启动子序列。
[0014]优选地，使用至少一种核酸酶将所述转录模板降解为单个核酸；
[0015]优选地，所述至少一种核酸酶包括Baseline
‑
ZERO
TM DNase；
[0016]优选地，所述至少一种核酸酶包括DNase I和第二互补DNase，所述第二互补DNase包含单链特异性3
’
至5
’
外脱氧核糖核酸酶；
[0017]优选地，所述第二互补DNase包括核酸外切酶I。
[0018]优选地，Baseline
‑
ZERO
TM DNase降解转录模板的反应条件为36～38℃反应15～60min；
[0019]优选地，Baseline
‑
ZERO
TM DNase降解转录模板的反应条件为37℃反应30min。
[0020]优选地，所述退火的反应条件为：先70～80℃维持5～10min，然后降温3～4h至40℃以下；
[0021]优选地，先75℃维持5min，然后降温3～4h至40℃以下。
[0022]优选地，使用S1核酸酶降解退火产物中的单链核酸的反应条件为：36～38℃反应15～30min；
[0023]优选地，使用S1核酸酶降解退火产物中的ssRNA的反应条件为：37℃反应20min。
[0024]优选地，所述纯化反应产物包括富集反应产物中的dsRNA；
[0025]优选地，醇沉反应产物，富集反应产物中的dsRNA；
[0026]优选地，所述纯化反应产物还包括使用苯酚
‑
氯仿抽提去除反应产物中的蛋白质；
[0027]优选地，所述纯化反应产物还包括使用凝胶过滤层析去除游离核苷酸。
[0028]优选地，所述dsRNA的长度至少为80bp；
[0029]优选地，所述dsRNA的长度为80～1000bp；
[0030]优选地，所述dsRNA的长度为300bp。
[0031]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了一种上述制备方法在制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种dsRNA的制备方法，其特征在于，包括：先经体外转录合成ssRNA，再将反应产物中的体外转录模板降解为单个核苷酸；然后退火形成dsRNA，再使用S1核酸酶降解退火产物中的单链核酸，纯化反应产物得到dsRNA。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述体外转录产物由T7 RNA聚合酶催化反应得到；优选地，所述体外转录产物的转录模板两端含有T7 RNA聚合酶启动子序列。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，使用至少一种核酸酶将所述转录模板降解为单个核酸；优选地，所述至少一种核酸酶包括Baseline
‑
ZERO
TM DNase；优选地，所述至少一种核酸酶包括DNase I和第二互补DNase，所述第二互补DNase包含单链特异性3
’
至5
’
外脱氧核糖核酸酶；优选地，所述第二互补DNase包括核酸外切酶I。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，Baseline
‑
ZERO
TM
DNase降解转录模板的反应条件为36～38℃反应15～60min；优选地，Baseline
‑
ZERO
TM DNase降解转录模板的反应条件为37℃反应30min...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿玉杰，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：