【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用。
技术介绍
1、甘油磷酸氧化酶(g3po，ec 1.1.3.21)是用耦联酶法测定甘油三酯含量的关键酶之一，目前，以其特有的高特异性和高灵敏度被广泛地应用于心脏病和高血脂的临床判断中。
2、对甘油磷酸氧化酶的研究始于二十世纪三十年代，主要研究对象是streptococcus faecalis来源的蛋白。目前已有的商品化甘油磷酸氧化酶往往来自于多步的分离纯化产物，主要生产国包括日本、美国和英国等。中国对甘油磷酸氧化酶的研究起步较晚，相关的报道并不是特别多，大部分用于临床诊断的甘油磷酸氧化酶仍需要进口。同时，随着人们生活水平的日益提高，工作压力日益增强，重视健康的理念逐渐被人们作为衡量生活品质高低的标准之一，因此，中国国内对甘油磷酸氧化酶的需求也呈现上升趋势。
3、目前关于甘油磷酸氧化酶的研究主要集中于pediococcus acidilactici，aerococcus viridans，streptococcus faecalis和enterococcus sp.等来源。专利文献cn110938607a报道了一种来源于pediococcus acidilactici的甘油磷酸氧化酶，还进行了随机突变，提高了热稳定性[1]。王腾等报道了一种采用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法，以streptococcus faecalis来源的g3po基因进行重组表达，以聚乙二醇-硫酸铵双水相萃取和两步层析纯化得到g3po目的蛋白[2
4、血清甘油三酯含量检测已经由此前的化学法基本完全转化为目前的酶法。酶法检测甘油三酯快速方便，准确率高，且可以应用在生化分析仪上，还可进行大批量检测。酶法检测的检测原理如下：待检测样品在脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase)的作用下水解生成甘油(glycerol)和脂肪酸(fatty acid)，甘油和atp在甘油激酶(glycerol kinase)作用下生成甘油-3-磷酸(glycerol-3-p)，甘油-3-磷酸在甘油磷酸氧化酶(l-α-glycerophosphate oxidase)作用下生成磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone-p)和双氧水(h2o2)，双氧水可以在4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-aa)、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠(toos)以及辣根过氧化物酶(peroxidase)作用下生成显色物质醌亚胺(quinoneimine dye)，根据醌亚胺在可见光下的吸收变化可以反应出甘油三酯的含量，达到检测的目的。具体的反应原理如下所示：
5、
6、
7、
8、
9、此前大部分甘油磷酸氧化酶是利用天然微生物发酵培养获得，产量低、纯化难度高，限制了酶法检测tg试剂的研发和普及，同时甘油磷酸氧化酶的稳定性也会大大影响试剂的检测准确性。
10、目前，绿色气球菌来源的甘油磷酸氧化酶(g3po)野生型稳定性有所欠缺，有待开发一种稳定性提高的甘油磷酸氧化酶突变体，从而提高其应用稳定性。
11、[1]邹炳德,邹继华,章玉胜,汪屹,张帅,张永.热稳定性好的甘油-3-磷酸氧化酶及其在试剂盒中的应用,cn 110938607 a.
12、[2]王腾,孟延发.用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法,cn101070529 a.
13、[3]高国生,董飞波,孙毅,华馨,张文宇,杨锦勋.一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法,cn 110184289 a.
技术实现思路
1、鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题之一是如何开发一种稳定性提高的甘油磷酸氧化酶(g3po)突变体，从而提高其应用稳定性。
2、本专利技术第一方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体(g3po突变体)，所述甘油磷酸氧化酶突变体基于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列进行定点突变，所述野生型甘油磷酸氧化酶(野生型g3po)的氨基酸序列如seq id no.:4所示，突变方式选自：d102n、t90v、a363s、f555e、f6l、g29p、g399k、g399e、a376k、g399p、h92q、a341t、e204d、v209n、s218t、l131v、v198a、t221s、h227r、v228r、e392k、t370s、i179s、s501a、k113g、q474f、v492t、s82a、q464n及包括前述突变方式的组合突变方式。
3、在本专利技术的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自d102n、t90v、a363s、f555e、f6l、g29p、g399k、g399e、a376k、g399p、h92q、a341t、e204d、v209n、s218t、l131v、v198a、t221s、h227r、v228r、e392k、t370s、i179s、s501a、k113g、q474f、v492t、s82a、q464n中至少两种突变方式组合而成的组合突变方式。
4、在本专利技术的一些较佳实施方式中，所述突变方式选自：d102n、t90v、a363s、f555e及包括前述突变方式的组合突变方式。
5、在本专利技术的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自以下任一种组合突变方式：
6、l4f+e574k，d102n+t90v+e574k，t370s+f555e+e574k等；
7、d102n+t90v+a363s+q464n+f555e+e574k，
8、t90v+a363s+f555e+i179s+v198a，
9、d102n+t90v+q464n+v492t+f555e+e574k，
10、d102n+t90v+a363s+f555e+f6l，
11、d102n+t90v+a376k+g399k+s501a+f555e，d102n+t90v+e574k，
12、d102n+t90v+a341t+t370s+q474f+e574k，d102n+t90v+a363s+f555e，
13、f6l+g29p+a341t+a363s+f555e+e574k等；
14、d102n+t90v+g399k本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甘油磷酸氧化酶突变体，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶突变体基于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列进行定点突变，所述野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.:4所示，突变方式选自：T90V、A363S、F555E、F6L、G29P、G399K、G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D、V209N、S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S、I179S、S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A、Q464N及包括前述突变方式的组合突变方式。
2.根据权利要求1所述甘油磷酸氧化酶突变体，其特征在于，所述组合突变方式选自T90V、A363S、F555E、F6L、G29P、G399K、G399E、A376K、G399P、H92Q、A341T、E204D、V209N、S218T、L131V、V198A、T221S、H227R、V228R、E392K、T370S、I179S、S501A、K113G、Q474F、V492T、S82A、Q464N中至少两种突变方式组合而成的
3.一种甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白在权利要求1-2中任一项所述甘油磷酸氧化酶突变体的N端和/或C端连接有融合标签。
4.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的核苷酸序列为下组中任一种核苷酸序列：
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求4所述核酸构建物。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的类型选自：pET 28a，pET30a，pANY1，pQE30，pG-KJE8，pGRO7，pKJE7，pG-Tf2，pTf16，pUC18，pUC19和pGEX。
7.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌的基因组整合有权利要求4所述核酸构建物，或者所述工程菌含有权利要求5或6所述重组载体。
8.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞的基因组整合有权利要求4所述核酸构建物，或者所述基因工程细胞含有权利要求5或6所述重组载体。
9.一种甘油磷酸氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.权利要求1-2中任一项所述甘油磷酸氧化酶突变体、权利要求3所述融合蛋白、权利要求4所述核酸构建物、权利要求5或6所述重组载体、权利要求7所述工程菌及权利要求8所述基因工程细胞在血清甘油三酯含量检测方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种甘油磷酸氧化酶突变体，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶突变体基于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列进行定点突变，所述野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列如seq id no.:4所示，突变方式选自：t90v、a363s、f555e、f6l、g29p、g399k、g399e、a376k、g399p、h92q、a341t、e204d、v209n、s218t、l131v、v198a、t221s、h227r、v228r、e392k、t370s、i179s、s501a、k113g、q474f、v492t、s82a、q464n及包括前述突变方式的组合突变方式。
2.根据权利要求1所述甘油磷酸氧化酶突变体，其特征在于，所述组合突变方式选自t90v、a363s、f555e、f6l、g29p、g399k、g399e、a376k、g399p、h92q、a341t、e204d、v209n、s218t、l131v、v198a、t221s、h227r、v228r、e392k、t370s、i179s、s501a、k113g、q474f、v492t、s82a、q464n中至少两种突变方式组合而成的组合突变方式；或者
3.一种甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白，其特征在于，所述甘油磷酸氧化酶突变体的融合...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫安，罗漫杰，钱坤，鄢文琪，陈敏娟，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。