【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种重组dnase i的发酵方法。
技术介绍
1、dnase i，即deoxyribonuclease i，中文名称为脱氧核糖核酸酶i，是一种可以消化单链或双链dna的核酸内切酶。它水解磷酸二酯键，产生含有5'-磷酸基团和3'-oh基团的单脱氧核苷酸和寡脱氧核苷酸。可广泛应用于不含dna的rna制备；去除体外转录之后的模板dna；在rt-pcr及rt-qpcr反应前制备不含dna的rna；结合dna聚合酶i通过切口移位进行dna标记；dna片段化文库构建。
2、在生物制品的生产过程中，需要严格控制核算污染尤其是残留dna，dnase i便能起到很好的去除效果。如近年来高速发展的mrna疫苗对一些传染疾病的预防起到重要的作用，而在mrna疫苗研发和生产过程中，dnase i是其中的关键酶原料之一。
3、最早的dnase i生产方法是从牛胰腺等组织中提取的方法，该方法原料不稳定、制备过程非常繁琐、易失活，不利于大规模生产；且为动物源性产品，安全性不能得到保障。目前一般的方法是通过重组基因工程菌的方法，但由于dnase i对宿主细胞存在严重的毒性，随着dnase i的表达会杀死宿主细胞，因而无法得到需要量的目标产物。
4、毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统因酵母是单细胞低等真核生物、培养条件简单、繁殖速度快、培养成本低、有利于大规模生产，且具有翻译后加工能力，可将外源蛋白分泌至胞外，性质较原核生物表达的蛋白更稳定，特别适合表达真核生物来源的蛋白的特点，可作
5、毕赤酵母作为外源蛋白的表达系统，既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等，同时它还避免了酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。
6、然而申请人发现利用毕赤酵母表达生产dnase i过程中，存在表达的dnase i蛋白被部分甚至完全降解、蛋白产量低等问题；基于此，有必要对毕赤酵母表达生产dnase i存在的缺陷进行改进。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提出了一种重组dnase i的发酵方法，以解决现有技术中存在的技术问题。
2、第一方面，本专利技术提供了一种重组dnase i的发酵方法，包括以下步骤：
3、将含有dnase i基因的重组毕赤酵母菌，经种子培养基扩培，然后接种至发酵培养基中发酵培养，待发酵培养基中甘油耗尽，溶解氧上升时，加入甘油，继续培养至发酵液od600值达到120～550后，停止补加甘油，饥饿，耗尽发酵液中的甘油，再加入甲醇诱导蛋白表达；
4、其中，在甲醇诱导蛋白表达过程中加入水溶性钙盐；
5、所述发酵培养基含有蛋白胨。
6、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，所述水溶性钙盐包括氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙、溴化钙、碘化钙、氯酸钙、高氯酸钙、高锰酸钙中的至少一种。
7、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，在甲醇诱导蛋白表达的过程中，加入盐酸苯甲脒。
8、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，所述在甲醇诱导蛋白表达过程中加入水溶性钙盐以使所述水溶性钙盐的浓度为10～50mm。
9、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，所述在诱导蛋白表达过程中加入盐酸苯甲脒的加入方式为：在甲醇中添加2.61-6.22g/l的盐酸苯甲脒或单独以相同的盐酸苯甲脒质量流速流加盐酸苯甲脒水溶液，或多次分批补加发酵液体积的0.5-2.34g/l的盐酸苯甲脒。
10、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，所述发酵培养基还包括磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸钾、氢氧化钾、硫酸镁、氯化钙、生物素、甘油、ptm1溶液、以及溶剂。
11、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，所述发酵培养基中蛋白胨的浓度为2～10g/l、磷酸二氢铵的浓度为5～40g/l、磷酸二氢钾的浓度为2～10g/l、硫酸钾的浓度为3.5～26.1g/l、氢氧化钾的浓度为1.5～2g/l、硫酸镁的浓度为10.5～18.5g/l、氯化钙的浓度为0.2～0.5g/l、生物素的浓度为0.02～0.3g/l、甘油的浓度为10～50g/l、ptm1溶液的浓度为2～5ml/l；
12、所述溶剂为水；
13、所述ptm1溶液包括以下浓度的组分：cuso4 5～7g/l、ki 0.08～0.09g/l、mnso4 2～4g/l、na2moo4 0.1～0.3g/l、h3bo3 0.01～0.03g/l、cocl2 0.4～0.6g/l、zncl2 19～21g/l、feso4 63～67g/l、浓h2so4 4～6ml/l；所述浓h2so4质量分数为98～99％。
14、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，将含有dnase i基因的重组毕赤酵母菌，经种子培养基扩培，然后接种至发酵培养基中发酵培养具体包括：
15、将含有dnase i基因的重组毕赤酵母菌接种至种子培养基中，培养至od600值为20～50，得到种子液；
16、将种子液接种至发酵培养基中发酵培养；
17、其中，所述种子培养基包括ypd培养基、pda培养基、bmgy培养基中的至少一种；
18、将含有dnase i基因的重组毕赤酵母菌接种至种子培养基的步骤中，培养温度为28～30℃；
19、将种子液接种至发酵培养基中发酵培养的步骤中，接种量为5～10％。
20、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，将种子液接种至发酵培养基中发酵培养，通过氨水控制ph为4.9～5.1，通入1.0～1.5vvm含氧气体，调节转速控制溶解氧≥20％，待发酵培养基中甘油耗尽，溶解氧上升至≥60％，加入甘油，继续培养至发酵液od600值达到120～550后，停止补加甘油，饥饿20～40min；其中，发酵培养温度为28～30℃。
21、优选的是，所述的重组dnase i的发酵方法，加入甲醇诱导蛋白表达的步骤中，调节甲醇流加速率，使甲醇的浓度为1～10g/l、诱导时间为70～90h、温度为20～27℃、ph为3.5～6.5。
22、本专利技术的一种重组dnase i的发酵方法，相比现有技术具有以下有益效果：
23、1、本专利技术的重组dnase i的发酵方法，发酵培养基中含有蛋白胨，甲醇诱导蛋白表达过程中添加水溶性钙盐；其中，蛋白胨富含多肽和氨基酸，为蛋白酶提供过量的底物，可竞争性抑制目的蛋白的水解，同时又可为细胞生长代谢提供营养；水溶性钙盐中提供ca2+，dnase i活性依赖于ca2+；且ca2+的添加可一定程度本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组DNase I的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，所述水溶性钙盐包括氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙、溴化钙、碘化钙、氯酸钙、高氯酸钙、高锰酸钙中的至少一种。
3.如权利要求1所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，在甲醇诱导蛋白表达的过程中，加入盐酸苯甲脒。
4.如权利要求1所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，所述在甲醇诱导蛋白表达过程中加入水溶性钙盐以使所述水溶性钙盐的浓度为10～50mM。
5.如权利要求3所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，所述在甲醇诱导蛋白表达过程中加入盐酸苯甲脒的加入方式为：在甲醇中添加2.61-6.22g/L的盐酸苯甲脒或单独以相同的盐酸苯甲脒质量流速流加盐酸苯甲脒水溶液，或多次分批补加发酵液体积的0.5-2.34g/L的盐酸苯甲脒。
6.如权利要求1～5任一所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括磷酸二氢
7.如权利要求6所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基中蛋白胨的浓度为2～10g/L、磷酸二氢铵的浓度为5～40g/L、磷酸二氢钾的浓度为2～10g/L、硫酸钾的浓度为3.5～26.1g/L、氢氧化钾的浓度为1.5～2g/L、硫酸镁的浓度为10.5～18.5g/L、氯化钙的浓度为0.2～0.5g/L、生物素的浓度为0.02～0.3g/L、甘油的浓度为10～50g/L、PTM1溶液的浓度为2～5ml/L；
8.如权利要求1所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，将含有DNase I基因的重组毕赤酵母菌，经种子培养基扩培，然后接种至发酵培养基中发酵培养具体包括：
9.如权利要求8所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，将种子液接种至发酵培养基中发酵培养，通过氨水控制pH为4.9～5.1，通入1.0～1.5VVM含氧气体，调节转速控制溶解氧≥20％，待发酵培养基中甘油耗尽，溶解氧升至≥60％，加入甘油，继续培养至发酵液OD600值达到120～550后，停止补加甘油，饥饿20～40min；其中，发酵培养温度为28～30℃。
10.如权利要求1～5任一所述的重组DNase I的发酵方法，其特征在于，加入甲醇诱导蛋白表达的步骤中，调节甲醇流加速率，使甲醇的浓度为1～10g/L、诱导时间为70～90h、温度为20～27℃、pH为3.5～6.5。
...【技术特征摘要】
1.一种重组dnase i的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的重组dnase i的发酵方法，其特征在于，所述水溶性钙盐包括氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙、溴化钙、碘化钙、氯酸钙、高氯酸钙、高锰酸钙中的至少一种。
3.如权利要求1所述的重组dnase i的发酵方法，其特征在于，在甲醇诱导蛋白表达的过程中，加入盐酸苯甲脒。
4.如权利要求1所述的重组dnase i的发酵方法，其特征在于，所述在甲醇诱导蛋白表达过程中加入水溶性钙盐以使所述水溶性钙盐的浓度为10～50mm。
5.如权利要求3所述的重组dnase i的发酵方法，其特征在于，所述在甲醇诱导蛋白表达过程中加入盐酸苯甲脒的加入方式为：在甲醇中添加2.61-6.22g/l的盐酸苯甲脒或单独以相同的盐酸苯甲脒质量流速流加盐酸苯甲脒水溶液，或多次分批补加发酵液体积的0.5-2.34g/l的盐酸苯甲脒。
6.如权利要求1～5任一所述的重组dnase i的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸钾、氢氧化钾、硫酸镁、氯化钙、生物素、甘油、ptm1溶液、以及溶剂。
7.如权利要求6所述的重组dnase i的发酵方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗漫杰，姜涛，王梁，施婧妮，徐灿，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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