【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及果蝇细胞基因技术改造领域，具体涉及一种结合多种基因表达元件的synnotch系统及其应用。
技术介绍
1、肿瘤生物学的相关研究已经揭示了肿瘤的形成主要由于基因改变的累积，比如原癌基因的激活以及肿瘤抑制基因的失活。例如，结肠癌的形成就是由于apc,k-ras,smad2/4以及p53等基因突变的累积。这证明细胞是克隆发展成恶性肿瘤的，即肿瘤细胞的克隆进化。然而，最近肿瘤基因组的分析揭示了肿瘤组织具有基因异质性。这些研究提供了一个概念，即肿瘤细胞的不同亚克隆能够通过细胞-细胞的相互作用驱动肿瘤生发。最近在小鼠模型的研究中也证明了克隆多样性确实有利于肿瘤发展。
2、在果蝇中的基因研究已经揭示了关键的肿瘤抑制基因，如hippo通路的成分并解析了其下游的机制。更重要的是，在果蝇中的基因镶嵌技术能完成在果蝇体内操纵并且可视化细胞克隆，以此揭示肿瘤向恶性肿瘤变化的分子机制。在果蝇成虫盘中，稳定表达激活的ras蛋白(rasv12)的细胞团能够形成良性肿瘤，当引入维持细胞顶端-底端极性的基因突变时，如scribble(scrib)或者discs large(dlg)，会导致良性肿瘤发展形成恶性肿瘤。最近果蝇中研究也证明原癌性的细胞克隆能够通过与正常上皮细胞、具有不同原癌性改变的肿瘤细胞以及其他类型细胞的细胞-细胞相互作用驱动肿瘤生发。
3、传统的notch信号通路包括胞外配体结合域(lbd)、受体负调控区(nrr)、跨膜区以及胞内域(icd)。当受体与配体结合，通过lbd传导张力，引起nrr的构象变化，进而暴
4、最近研究证明包含nrr和跨膜区的notch core区域可以作为一种模块化的组分构建组成型notch(synnotch)受体系统，在维持notch激活机制的同时可以可选择性的替换原先系统中的lbd与icd。在我们之前的研究中证明，notch信号的lbd及其配体可以替换为gfp及其配体gfp纳米抗体(gfp nanobody)；icd可以替换为qf转录因子。
5、同时，果蝇基因镶嵌技术中，重组酶(flippase/flp)可以将同向的两个frt位点之间的dna序列切割；同时，在果蝇中gal4及lexa的表达可以分别与uas及lexaop结合，诱导下游蛋白表达。
6、现有技术将synnq与一个转录停止信号结合，在其两侧加上frt序列，将整个表达盒插入到gfp ligand之前，并将整个结构置于组成型ubi启动子的控制下。在没有flp重组酶的情况下，synnq在所有细胞中普遍表达，gfp配体的表达被阻断，当flp存在时，synnq被切除，允许gfp配体的表达。两种细胞通过gfp-gfp ligand的结合，诱导notch信号通路，促进下游的转录因子qf的释放和表达。qf-quas系统的特殊性，对于其后续的扩展具有局限性，只完成了对于单一细胞的可控表达，现有技术重组酶(flp)的表达依赖于gal4-uas系统，因此对于重组酶(flp)在果蝇体内的全域的表达也具有一定的局限性。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种结合多种基因表达元件的synnotch系统及其应用。
2、本专利技术的具体方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供一种synnotch系统，其包括顺次连接的frt序列、gfp蛋白结合区域、notch core区、启动调控蛋白gal4区、frt序列和启动调控蛋白lexa区，所述frt序列、gfp蛋白结合区域、notch core区、启动调控蛋白gal4区、启动调控蛋白lexa区的核苷酸序列依次如seq id no.1-5所示。
4、第二方面，本专利技术提供所述synnotch系统在制备调控果蝇细胞中目的基因或蛋白表达的产品中的应用，所述蛋白为红色荧光蛋白和/或绿色荧光蛋白，所述基因为肿瘤相关基因。
5、进一步的，所述绿色荧光蛋白、肿瘤相关基因序列前包含调控蛋白区的核酸序列lexaop，所述红色荧光蛋白序列前包含调控蛋白区的核酸序列uas，所述lexaop和uas的核苷酸序列依次如seq id no.6-7所示。
6、更进一步的，所述果蝇细胞中还表达重组酶flippase，其核苷酸序列如seq idno.8所示。
7、第三方面，本专利技术提供一种基因表达元件，包括所述的synnotch系统、红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和重组酶flippase，所述绿色荧光蛋白、肿瘤相关基因序列前包含调控蛋白区的核酸序列lexaop，所述红色荧光蛋白序列前包含调控蛋白区的核酸序列uas。
8、进一步的，所述synnotch系统、红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和重组酶flippase分别构建表达框进行基因表达，所述表达框构建于同一载体或多个载体中。
9、第四方面，本专利技术提供一种重组表达载体，包括所述的基因表达元件。
10、第五方面，本专利技术提供所述重组载体在构建果蝇肿瘤模型中的应用。
11、进一步的，所述果蝇肿瘤模型中肿瘤细胞及其邻近细胞相互接触并表达不同荧光蛋白。
12、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
13、synnotch结构正常情况下表达并定位与细胞膜，而在引入重组酶后，通过flp-frt系统诱导lexa的表达，并通过lexa-lexaop系统调控绿色荧光蛋白gfp的表达，通过gfp-gfpnanobody的结合，形成细胞-细胞相互作用，诱导notch信号通路，释放gal4转录因子，通过gal4-uas系统调控红色荧光蛋白的表达，使得两种细胞都可视化。
14、本专利技术不仅利用gal4-uas及lexa-lexaop两套系统完成了对于两种细胞系的定位和可视化，也保留这对于两种细胞后续的修饰和基因表达的可能性。
15、本专利技术完成了在果蝇这种多细胞生物体内的细胞相互作用的调控，并可用于肿瘤细胞与临近细胞相互作用的研究。本专利技术利用gal4-uas系统，摒弃了更为特殊和局限的qf-quas系统，可以充分利用果蝇研究中已经累积的丰富的gal4-uas果蝇品系进行更广阔的研究。
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1.一种SynNotch系统，其特征在于，其包括顺次连接的FRT序列、GFP蛋白结合区域、Notch core区、启动调控蛋白GAL4区、FRT序列和启动调控蛋白LexA区，所述FRT序列、GFP蛋白结合区域、Notch core区、启动调控蛋白GAL4区、启动调控蛋白LexA区的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-5所示。
2.权利要求1所述SynNotch系统在制备调控果蝇细胞中目的基因或蛋白表达的产品中的应用，其特征在于，所述蛋白为红色荧光蛋白和/或绿色荧光蛋白，所述基因为肿瘤相关基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述绿色荧光蛋白、肿瘤相关基因序列前包含调控蛋白区的核酸序列LexAop，所述红色荧光蛋白序列前包含调控蛋白区的核酸序列UAS，所述LexAop和UAS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.6-7所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述果蝇细胞中还表达重组酶Flippase，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种基因表达元件，其特征在于，包括权利要求1所述的SynNot
6.根据权利要求5所述的基因表达元件，其特征在于，所述SynNotch系统、红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和重组酶Flippase分别构建表达框进行基因表达，所述表达框构建于同一载体或多个载体中。
7.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求5所述的基因表达元件。
8.权利要求7所述重组载体在构建果蝇肿瘤模型中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述果蝇肿瘤模型中肿瘤细胞及其邻近细胞相互接触并表达不同荧光蛋白。
...【技术特征摘要】
1.一种synnotch系统，其特征在于，其包括顺次连接的frt序列、gfp蛋白结合区域、notch core区、启动调控蛋白gal4区、frt序列和启动调控蛋白lexa区，所述frt序列、gfp蛋白结合区域、notch core区、启动调控蛋白gal4区、启动调控蛋白lexa区的核苷酸序列依次如seq id no.1-5所示。
2.权利要求1所述synnotch系统在制备调控果蝇细胞中目的基因或蛋白表达的产品中的应用，其特征在于，所述蛋白为红色荧光蛋白和/或绿色荧光蛋白，所述基因为肿瘤相关基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述绿色荧光蛋白、肿瘤相关基因序列前包含调控蛋白区的核酸序列lexaop，所述红色荧光蛋白序列前包含调控蛋白区的核酸序列uas，所述lexaop和uas的核苷酸序列依次如seq id no.6-7所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述果蝇细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：何立，马哲贤，夏月琴，夏偲桢，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：
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