一种糖探针分子、其制备方法和使用其标记核心岩藻糖基化蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了下式所示的一种糖探针分子、其制备方法和使用其标记核心岩藻糖基化蛋白的方法。使用本发明专利技术的糖探针分子，利用一步标记法，实现了核心岩藻糖基化蛋白的高效标记，标记效率约为两步法的3

【技术实现步骤摘要】
一种糖探针分子、其制备方法和使用其标记核心岩藻糖基化蛋白的方法


[0001]本专利技术属于糖化学与生物学，具体而言涉及一种糖探针分子、其制备方法和使用其标记核心岩藻糖基化蛋白的方法。

技术介绍

[0002]糖基化修饰是哺乳动物体内一种重要的翻译后修饰过程。在体内，糖与蛋白或者脂类连接形成糖蛋白和糖脂。聚糖结构具有复杂性，这主要与两方面有关：单糖种类的多样性以及各个单糖之间链接方式的多样性。复杂糖基化修饰的研究被称为糖组学(glycome)，包括细胞对核苷酸糖供体、糖蛋白或糖脂受体、糖基转移酶和糖苷酶在时空上的调控。糖与多肽上的氮原子或氧原子链接，进而继续延伸而形成的糖聚合物分别被称为N
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聚糖(N
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glycans)和O
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聚糖(O
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glycans)。
[0003]糖基化修饰的变化与细胞功能相关，其中肿瘤细胞的糖基化修饰与正常细胞的有很多不同。例如，甲胎蛋白(AFP)是肝细胞癌(HCC)的重要生物标志物，而其在一些良性肝病中表达量也会升高。但是，甲胎蛋白的核心岩藻糖修饰只在肝癌细胞中升高，因此，核心岩藻糖修饰的AFP是更可靠的肝细胞癌生物标志物。2005年，甲胎蛋白异质体(AFP
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L3)被美国食品与药品监督管理局(FDA)批准为肝细胞癌的肿瘤标志物。研究表明，血清蛋白核心岩藻糖修饰的增加也与前列腺癌转移风险的增加有关。核心岩藻糖化触珠蛋白(haptoglobin)是胰腺癌(pancreatic cancer)检测的潜在生物标志物。
[0004]免疫球蛋白(抗体IgG)与自然杀伤细胞和巨噬细胞表面的受体(FcγRIIIa，CD16)结合从而诱导免疫反应，抗体Fc区的核心岩藻糖化会破坏这种相互作用，导致抗体与受体的亲和力会降低20
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30倍。无核心岩藻糖化抗体比例高的登革热感染者更容易患上严重的溶血性疾病。而且，新型冠状病毒(COVID
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19)重症患者体内无核心岩藻糖基化蛋白的抗病毒IgG水平明显高于轻症患者。研究表明，核心岩藻糖基化蛋白参与细胞内重要信号通路的调控，并与多种疾病的发生发展有关。综上所述，核心岩藻糖基化蛋白上的靶点及位点的发现可以为研究核心岩藻糖基化蛋白的生物学意义提供依据。
[0005]多糖的生物合成过程没有模板，因此基因编辑等技术方法不能用于多糖的研究，这导致多糖研究非常具有挑战性。目前，多糖的研究方法主要有5种：凝集素、抗体、化学法、代谢标记法和酶标记法。大部分糖的免疫原性低，这导致糖抗体很难制备且亲和力低，大部分凝集素对多糖的识别缺乏严谨的特异性，很难实现特定糖基化修饰的研究。化学方法一般具有破坏性且特异性低，例如过碘酸检测唾液酸。代谢标记需要利用活细胞的代谢系统，所以代谢标记法有两个限制：1)单糖类似物或者代谢前体会参与到多种糖复合物的生物合成途径中，无法实现特定糖基化修饰和特定寡糖结构的标记，2)单糖类似物需要经历细胞内代谢过程中多种酶的转化来完成标记，所以单糖类似物的结构变化有限。此外，代谢标记也无法用于人体组织样本糖基化修饰的研究。而糖基化修饰的化学酶法标记策略具有高特异性和高灵敏性的特点。近年，一步法标记寡糖结构的研究也有诸多报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术建立了一步酶法标记核心岩藻糖基化蛋白的策略，发展了一种简单而高效的标记方法来实现核心岩藻糖基化蛋白的快速标记，可以在肽水平、蛋白水平、细胞水平以及人体组织水平实现核心岩藻糖基化蛋白的一步法标记及可逆性释放，释放后的核心岩藻糖基化蛋白可以直接用于质谱检测及蛋白质组学分析，为发现核心岩藻糖基化的新靶点和新位点提供有效手段。
[0007]一方面，本专利技术提供了式I所示的糖探针分子：
[0008][0009]其中，R为N3或
[0010]n为0至4的整数，例如0，1，2，3，4。
[0011]另一方面，本专利技术提供了一种糖探针分子的制备方法，包括以下步骤：
[0012][0013]其中，使化合物a与2
‑
氯
‑
1,3
‑
二甲基氯代咪唑啉(DMC)经脱水反应得到式I的糖探
针分子，
[0014]其中，R为N3或
[0015]n为0至4的整数，例如0，1，2，3，4。
[0016]在一个实施方式中，上述反应可以在碱存在下进行。所述碱可以为三乙胺，但不限于此。
[0017]在一个实施方式中，化合物a可以按照本领域中任何已知的方法制备，或者可以是市售的。
[0018]在一个实施方式中，化合物a如下制备：
[0019][0020]使OG和9
‑
叠氮唾液酸经糖基化反应得到9
‑
叠氮唾液酸十糖(9N3‑
SCT)；
[0021][0022]Biotin
‑
SCT:
[0023]使9N3‑
SCT和生物素
‑
炔烃分子(Biotin
‑
Alkyne)反应得到生物素化十糖(Biotin
‑
SCT)，其中n为0
至4的整数，例如0，1，2，3，4。
[0024]再一方面，本专利技术提供了根据本专利技术的糖探针分子在标记核心岩藻糖基化蛋白中的应用。例如，使用根据本专利技术的糖探针分子制备用于标记核心岩藻糖基化蛋白的试剂，或者在肽水平、蛋白水平、细胞水平以及人体组织水平上标记核心岩藻糖基化蛋白。
[0025]再一方面，本专利技术提供了一种标记核心岩藻糖基化蛋白的方法，其选自如下方法：
[0026]方法一，其为一步法，包括：使用本专利技术的糖探针分子，在糖苷内切酶及糖合成酶的作用下，对核心岩藻糖基化蛋白进行标记的步骤，其中，式I中，R为其中n为0至4的整数，例如0，1，2，3，4；
[0027]或者，
[0028]方法二，其为两步法，包括：使用本专利技术的糖探针分子，在糖苷内切酶及糖合成酶的作用下，对核心岩藻糖基化蛋白进行标记的步骤，以及对标记后的蛋白添加生物素标记的步骤，其中，式I中，R为N3。
[0029]上述对核心岩藻糖基化蛋白进行标记的步骤可以如下进行，糖苷内切酶与待标记的对象作用，暴露待标记的核心岩藻糖位点，然后将本专利技术的糖探针分子，在糖合成酶的存在下与已处理过的对象反应。所述待标记的对象没有特别限制，只要其带有核心岩藻糖基化蛋白即可，例如可以是带有核心岩藻糖基化的抗体或细胞，但不限于此。
[0030]上述对标记后的蛋白添加生物素标记的步骤可以如下进行：糖合成酶处理过的对象与生物素
‑
炔烃反应，完成添加生物素标记步骤。
[0031]优选地，本专利技术方法中，所述糖苷内切酶是指来自脑膜炎败血症伊丽莎白菌的糖苷酶，其实例包括，但不限于酶EndoF3，所述糖合成酶是指来自脑膜炎败血症伊丽莎白菌的糖苷酶的糖合成酶突变体，其实例包括，但不限于酶EndoF3
‑
D165A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.式I所示的糖探针分子：其中，R为N3或n为0至4的整数。2.一种糖探针分子的制备方法，包括：使化合物a与2
‑
氯
‑
1,3
‑
二甲基氯代咪唑啉(DMC)经脱水反应得到式I所示的糖探针分子，
其中，R为N3或n为0至4的整数。3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述反应在碱存在下进行，优选地，所述碱为三乙胺。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述化合物a如下制备：使OG和9
‑
叠氮唾液酸经糖基化反应得到9
‑
叠氮唾液酸十糖(9N3‑
SCT)；使9N3‑
SCT和生物素
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炔烃分子(Biotin
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Alkyne)反应得到生物素化十糖(Biotin
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SCT)，其中n为0至4的整数。5.如权利要求1所述的糖探针分子在标记核心岩藻糖基化蛋白中的应用。6.一种标记核心岩藻糖基化蛋白的方法，其选自如下方法：
方法一，包括：使用权利要求1所述的糖探针分子，在糖苷内...

【专利技术属性】
技术研发人员：文留青，田银平，尹泓博，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：