半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及抗原制备技术领域，具体涉及半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用，制备方法中采用富含半乳甘露聚糖的菌液经提取、酶解、纯化、超滤过滤等步骤制备获得的半乳甘露聚糖GM，同时还提供了所述半乳甘露聚糖GM在制备半乳甘露聚糖多克隆抗体、检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒中的应用。本发明专利技术提供的制备方法制得的半乳甘露聚糖GM纯度更高且更适于批量生产。生产。

【技术实现步骤摘要】
半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及抗原制备
，具体涉及半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]曲霉菌感染的典型原因是烟曲霉(约90％)，其次是黄曲霉、黑曲霉、和土曲霉。侵袭性曲霉菌病发生率在真菌感染中居第二位，仅次于念珠菌，每年有超过25万人感染，死亡率高达50％。侵袭性曲霉病已成为免疫功能低下宿主的主要死亡原因，包括移植患者、接受血液学恶性肿瘤治疗的患者和接受高剂量皮质类固醇治疗的患者。此外，在造血干细胞移植后的非中性粒细胞减少期和非经典情况下，如重症患者的重症监护病房。高死亡率的部分原因是很难在感染早期建立诊断，因为其发病隐匿，进展迅速，临床症状和影像学不够典型和特异，培养的敏感性很低，缺乏安全有效的抗真菌治疗手段，疾病死亡率高，故早期、快速、正确地鉴定出曲霉感染，对目标治疗具有重要的临床意义。改进及时诊断的技术主要集中在检测真菌释放的循环替代标记物上。随着基于非培养的方法的发展，如PCR和抗原检测，可以在侵袭性疾病患者感染的早期阶段检测到循环标记物。
[0003]半乳甘露聚糖是曲霉菌细胞壁的特有成分，GM试验是侵袭性曲霉菌病的早期诊断方法，尤其在有高危因素患者的筛查，已被国内外专家共识及指南推荐。GM抗原广泛存在于曲霉菌属的菌丝及孢子中，在部分植物中也会存在这种成分，比如大豆，GM抗原干粉的外观为白色、粉末状，在酸、盐环境下有极好的耐受性，比较耐热，在水中溶解度非常大，可形成透明溶液，GM抗原是一种以甘露聚糖为主链，以呋喃半乳糖为侧链的多糖。
>[0004]既往研究从曲霉菌培养菌体中提取半乳甘露聚糖，工艺复杂且产量较低。目前，本领域迫切需要开发一种简便、高效、低成本、特异性高的曲霉菌半乳甘露聚糖的制备方法，并能够有效地避免使用有毒有害的化学试剂。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用，本专利技术提供的制备方法制得的半乳甘露聚糖GM纯度更高且更适于批量生产。
[0006]本专利技术提供了半乳甘露聚糖的制备方法，包括如下步骤：
[0007]步骤1、取含半乳甘露聚糖的灭活菌液经抽滤、醇沉、离心、洗涤、干燥处理，获得半乳甘露聚糖粗提物；
[0008]步骤2、取所述半乳甘露聚糖粗提物经酶解、加热、碱酸处理、透析后，获得透析产物；
[0009]步骤3、取所述透析产物经超滤过滤后，获得所述半乳甘露聚糖。
[0010]进一步地，步骤1中，收集所述抽滤后的沉淀，经破碎、醇沉、离心、洗涤、干燥处理，获得细胞壁中的半乳甘露聚糖粗提物。
[0011]在一些实施例中，步骤1中，所述灭活菌液的菌种选自曲霉菌、毛霉菌、青霉菌和念珠菌中的至少一种。本领域技术人员知晓，所述生物体只要分泌半乳甘露聚糖即可，并不限
于上述具体生物。
[0012]优选地，步骤1中，所述含半乳甘露聚糖的灭活菌液按照以下方法制备得到：
[0013]取所述菌种接种至培养基中，培养至菌液OD600大于1.0时，进行灭活处理获得所述灭活菌液。
[0014]进一步地，所述培养基选自PDA培养基、沙氏培养基、察氏培养基和麦芽汁培养基中的至少一种，所述培养的方法采用平板培养、斜面培养、摇瓶振荡培养或发酵罐培养中的至少一种，所述灭活处理的方法采用化学试剂、射线、高温和高渗透压中的至少一种。
[0015]优选地，步骤1中，所述抽滤后的溶液中加入2～6倍体积的甲醇或乙醇进行醇沉，所述醇沉的时间为1～48小时，所述洗涤采用甲醇或乙醇，所述干燥处理采用烘干、冻干、减压干燥中的一种或多种。
[0016]更优选地，所述抽滤后的溶液中加入4倍体积的甲醇或乙醇进行醇沉，所述醇沉的时间为6～24小时。
[0017]在一些实施例中，步骤2中，所述酶解采用的酶包括淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶和几丁质酶中的至少一种，所述酶解的溶液中包含2～5wt％的酶，所述酶解的温度为20～60℃，时间为6～72小时。
[0018]优选地，所述酶解温度为30～45℃，酶解时间为12～24小时。
[0019]在一些具体实施例中，采用pH为7.4的0.01M PBS为酶解缓冲液溶解所述半乳甘露聚糖粗提物。
[0020]本专利技术通过酶解除去产物中混杂的葡聚糖、几丁质、纤维素、果胶等多糖杂质，通过煮沸、碱酸处理使酶灭活，并除去其他蛋白，仅保留半乳甘露聚糖，有效除去半乳甘露聚糖中的蛋白和氨基，采用透析除去小分子物质，进一步提高了半乳甘露聚糖的纯度，从而获得更准确的技术效果。
[0021]在一些实施例中，步骤3中，所述超滤过滤包括取所述透析产物依次经300KD和10KD超滤管过滤处理后，获得所述半乳甘露聚糖。
[0022]将半乳甘露聚糖通过超滤管进行分离，进一步消除残余的小蛋白，根据不同分子量大小截留不同，从而得到尺寸均匀的半乳甘露聚糖纯品，从而获得更准确的技术效果。
[0023]本专利技术提供了所述的制备方法制得的半乳甘露聚糖。
[0024]本专利技术提供了所述的半乳甘露聚糖在制备半乳甘露聚糖多克隆抗体和/或检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒中的应用。
[0025]本专利技术提供了检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒，包括所述的制备方法制得的半乳甘露聚糖。
[0026]本专利技术提供了侵袭性真菌的检测方法，包括采用所述检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒对样本进行检测。
[0027]本专利技术提供了半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用，制备方法中采用富含半乳甘露聚糖的菌液经提取、酶解、纯化、超滤过滤等步骤制备获得的半乳甘露聚糖GM，同时还提供了所述半乳甘露聚糖GM在制备半乳甘露聚糖多克隆抗体、检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒中的应用。与现有技术相比：
[0028]1、使用本专利技术方法得到的半乳甘露聚糖抗原纯度更高，消除了半乳糖胺、蛋白或其它杂质的干扰；
[0029]2、本专利技术制备的半乳甘露聚糖抗原分子量分布均一、尺寸均匀，消除了粗提物中杂糖的干扰。
[0030]3、本专利技术采用菌液上清提取半乳甘露聚糖并对其纯化制备得到的半乳甘露聚糖抗原原材料来源广泛、操作简单、成本低、产量高，且具有优良的免疫活性。
附图说明
[0031]图1示多糖含量测定标准曲线；
[0032]图2示酶解前HP
‑
GPC图；
[0033]图3示酶解后HP
‑
GPC图；
[0034]图4示采用GPC
‑
RI
‑
MALS测定半乳甘露聚糖分子量结果图。
具体实施方式
[0035]本专利技术提供了半乳甘露聚糖GM及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.半乳甘露聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、取含半乳甘露聚糖的灭活菌液经抽滤、醇沉、离心、洗涤、干燥处理，获得半乳甘露聚糖粗提物；步骤2、取所述半乳甘露聚糖粗提物经酶解、加热、碱酸处理、透析后，获得透析产物；步骤3、取所述透析产物经超滤过滤后，获得所述半乳甘露聚糖。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，收集所述抽滤后的沉淀，经破碎、醇沉、离心、洗涤、干燥处理，获得细胞壁中的半乳甘露聚糖粗提物。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述灭活菌液的菌种选自曲霉菌、毛霉菌、青霉菌和念珠菌中的至少一种。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述含半乳甘露聚糖的灭活菌液按照以下方法制备得到：取所述菌种接种至培养基中，培养至菌液OD600大于1.0时，进行灭活处理获得所述灭活菌液；其中，所述培养基选自PDA培养基、沙氏培养基、察氏培养基和麦芽汁培养基中的至少一种，所述培养的方法采用平板培养、斜面培养、摇瓶振荡培养或发酵罐培养中的至少一种，所述灭活处理的方法采用化...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔珍珍，王新明，吴文娟，李博，吴学炜，付光宇，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：