一种筛选作为dsRNA通道的SIDT1抗体的方法技术

本发明专利技术涉及抗体制备技术领域，尤其涉及一种筛选作为dsRNA通道的SIDT1抗体的方法，所述方法包括如下步骤：(1)用纯化的SIDT1胞外段蛋白作为抗原，对小鼠进行免疫；(2)NS

【技术实现步骤摘要】
一种筛选作为dsRNA通道的SIDT1抗体的方法


[0001]本专利技术涉及抗体制备
，尤其涉及一种筛选作为dsRNA通道的SIDT1抗体的方法。

技术介绍

[0002]干扰RNA系统在线虫中起到重要的调节作用，而SID
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1蛋白作为dsRNA的通道又是信息传递的关键。SID
‑
1同源蛋白同时也存在于无脊椎动物，在脊椎动物中更有广泛分布，证明这个蛋白家族可能是有古老的起源并且一直保持着相对保守的功能。越来越多的证据表明，RNA不再仅仅是DNA和蛋白质之间信息的传递者，其本身就具有重要的生理功能，它们来自于基因组转录但却不编码蛋白，在RNA水平上行使特定的功能。SID
‑
1及其同源蛋白SIDT1/SIDT2等，特异性识别dsRNA，并作为其特异性的重要通道使其进入细胞或者让信息在细胞间传递，可能是解析非编码RNA调控功能重要的环节。但是迄今为止关于这个蛋白的功能及机制的研究才刚刚开始，我们希望通过这个项目的研究，从结构上解析这个复杂跨膜糖蛋白的结构特征，研究dsRNA通过进入细胞的分子机制。以结构为基础，更加深刻的理解dsRNA对细胞的调控，进而深入的研究这个蛋白的功能和复杂的RNA调控网络。
[0003]高纯度SIDT1样品的获得很有难度，蛋白含有832个氨基酸残基，10个糖基化位点，11次跨膜结构。同时，SIDT1行使功能时又很可能是以多聚体的形式，为了解析其结构并且了解其作为通道蛋白运输dsRNA的机制，得到具有生物学功能并且高纯度的样品至关重要。现有技术中有如下几种方案：(1)昆虫细胞表达人SIDT1蛋白：悬浮的昆虫细胞系常被用作真核蛋白的表达，细胞培养体系容易扩大，表达后的蛋白在细胞内可以进行糖基化等翻译后修饰，容易得到有活性的蛋白。(2)人源细胞表达：HEK
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293细胞是人源蛋白表达常用的细胞系，有文献报道可以利用其表达SIDT1。(3)利用昆虫细胞表达的SIDT1胞外段制备单克隆抗体，利用抗体从动物组织中直接提取：SIDT1蛋白属于跨膜通道蛋白，在组织中分布广泛，行使功能时可能是以多聚体的形式，外源表达形成有活性蛋白的难度较大。通过对基因的分析，发现其在动物胃肠道，脑，肝，肺等表达相对较高。猪SIDT1与人SIDT1同源性较高，同时考虑到脏器来源以及处理难度，猪小肠可以作为蛋白提取的原材料。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一个方面提供了一种筛选作为dsRNA通道的SIDT1抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
[0005](1)用纯化的SIDT1胞外段蛋白作为抗原，对小鼠进行免疫；
[0006](2)NS
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1骨髓瘤细胞的制备；
[0007](3)免疫脾细胞的制备；
[0008](4)细胞融合；
[0009](5)阳性杂交瘤细胞筛选；
[0010](6)单克隆抗体的制备与纯化；
[0011](7)单克隆抗体的纯化。
[0012]在一些实施方式中，所述步骤(1)包括用纯化的SIDT1胞外段蛋白作为抗原，免疫6
‑
8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，第三次常规免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60μg/只，进行加强免疫一次。
[0013]在一些实施方式中，所述步骤(2)包括于融合前一周，将保存在液氮中的NS
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1骨髓瘤细胞复苏，培养在25cm2细胞培养瓶中；用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/mL；融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清DMEM培养液，将细胞轻轻吹下，移入50mL离心管，400g离心5分钟，洗涤细胞3次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用。
[0014]在一些实施方式中，所述步骤(3)包括取免疫效果最好的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，将消毒好的小鼠固定好，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入40μm细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；400g离心5min，洗涤细胞3次，弃上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用。
[0015]在一些实施方式中，所述步骤(4)包括将NS
‑
1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，400g离心10min。吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG溶液1mL；并不断用移液管轻轻搅拌细胞1min；然后向细胞混合物中加入10mLDMEM培养基，第一分钟逐滴滴入1mL，第二分钟加1mL，第3min
‑
4min加3mL，5min后加其余的5mL；将细胞混合物置于37℃水浴孵育15min；然后400g离心5min，除去上清，用20mL15％胎牛血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，并转移至75cm2细胞培养瓶中，置于细胞培养箱孵育16
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24h。将融合后的细胞悬液转移到50mL离心管，400g离心10min；去除上清，细胞沉淀用2.5mL15％胎牛血清DMEM培养基重悬，加入22.5mL半固体培养基混匀后倒入直径3.5cm的平皿中，每个平皿约2mL，37℃，5％ CO2培养。十天后肉眼可见平皿的培养基表面有肉眼可见的白色细胞克隆团。
[0016]在一些实施方式中，所述步骤(5)包括无菌条件下将平皿中的细胞团吸起放入96孔板培养液中，继续培养4天。4天后进行间接ELISA检测。将抗原以100ng/孔包被至酶标板，4℃过夜，洗涤三次，加200mL封闭液，于37℃温育2h，洗涤三次，然后加入杂交瘤细胞培养上清，于37℃温育2h，洗涤液洗三次后加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG
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HRP，37℃温育1h，洗涤三次后37℃避光显色10min,显色充分后加入2M H2SO4终止反应,酶标仪在波长450nm处测定吸光值(OD值)；同时用免疫前正常小鼠血清为阴性对照，免疫后小鼠血清作阳性对照，则吸光值大于阴性对照组2.1倍判定为阳性。检出细胞生长孔有特异性抗体，且呈单个克隆生长并形态良好的杂交瘤细胞孔，再克隆；至少3次后阳性孔的杂交瘤细胞移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，冻存杂交瘤细胞。
[0017]在一些实施方式中，所述步骤(6)包括注射0.5mL液体石蜡至8周龄BALB/c小鼠腹腔；将杂交瘤细胞以1
×
105个/mL的浓度接种于25cm2培养瓶内，培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1
×
106接种到已注射液体石蜡的小鼠腹腔；7
‑
10天后收集腹水。
[0018]在一些实施方式中，所述步骤(7)包括腹水用20mM PBS pH7.4稀释3倍以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选作为dsRNA通道的SIDT1抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)用纯化的SIDT1胞外段蛋白作为抗原，对小鼠进行免疫；(2)NS
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1骨髓瘤细胞的制备；(3)免疫脾细胞的制备；(4)细胞融合；(5)阳性杂交瘤细胞筛选；(6)单克隆抗体的制备与纯化；(7)单克隆抗体的纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括用纯化的SIDT1胞外段蛋白作为抗原，免疫6
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8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，第三次常规免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60μg/只，进行加强免疫一次。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括于融合前一周，将保存在液氮中的NS
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1骨髓瘤细胞复苏，培养在25cm2细胞培养瓶中；用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/mL；融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清DMEM培养液，将细胞轻轻吹下，移入50mL离心管，400g离心5分钟，洗涤细胞3次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括取免疫效果最好的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，将消毒好的小鼠固定好，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入40μm细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；400g离心5min，洗涤细胞3次，弃上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包括将NS
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1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，400g离心10min。吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG溶液1mL；并不断用移液管轻轻搅拌细胞1min；然后向细胞混合物中加入10mLDMEM培养基，第一分钟逐滴滴入1mL，第二分钟加1mL，第3min
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4min加3mL，5min后加其余的5mL；将细胞混合物置于37℃水浴孵育15min；然后400g离心5min，除去上清，用20mL15％胎牛血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，并转移至75cm2细胞培养瓶中，置于细胞培养箱孵育16
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24h。将融合后的细胞悬液转移到50mL离心管，400g离心10min；去除上清，细胞沉淀用...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪涛，邬玉兰，刘丽，
申请(专利权)人：深圳湾实验室，
类型：发明
国别省市：