突变的Cas12j蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种突变的Cas12j蛋白及其应用，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
突变的Cas12j蛋白及其应用
[0001]本专利技术为申请日2023年2月3日，名称为“突变的Cas12j蛋白及其应用”的中国专利申请CN 2023100922319的分案申请。


[0002]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术涉及一种活性提高的突变的Cas12j蛋白及其应用。

技术介绍

[0003]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0004]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
’‑
NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
’‑
TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
’‑
TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0005]中国专利技术专利CN111770992B中公开了一种Cas蛋白Cas12j.19，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，但是，其编辑活性并不高，为了提高该蛋白的编辑效率，本申请对该蛋白进行了优化，提高了其在真核细胞中的编辑效率。

技术实现思路

[0006]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对Cas12j.19(本申请中将其称之为，Cas12j19)蛋白的定点突变，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围。
[0007]Cas效应蛋白
[0008]一方面，本专利技术提供了一种活性改善或活性提高的Cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第100位。
[0009]在一个实施方式中，所述第100位氨基酸突变为非E的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，突变为K，Y，M，F，R，W，S，H，V，I，N，C或L。
[0010]在一个实施方式中，所述亲本Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
[0011]在一个实施方式中，所述亲本Cas蛋白为Cas12家族的Cas蛋白，优选，Cas12j家族的Cas蛋白，例如，CN111770992B公开的Cas12j.3
‑
Cas12j.22等；在优选的实施方式中，所述亲本Cas蛋白为Cas12j19；所述Cas12j19的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％或100％的序列同一性。
[0012]在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白选自以下I
‑
III任意一组：
[0013]I、由SEQ ID No.1所示氨基酸序列在包含以下氨基酸位点处产生突变得到的Cas突变蛋白：第100位；优选的，所述第100位氨基酸突变为非E的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，突变为K，Y，M，F，R，W，S，H，V，I，N，C或L；
[0014]II、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的Cas突变蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性的Cas突变蛋白；
[0015]III、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的Cas突变蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。
[0016]来自多种生物体的Cas蛋白或Cas12j蛋白都可以用作亲本Cas蛋白，在一些实施方式中，所述亲本Cas蛋白或Cas12j蛋白具有核酸酶活性。在一些实施方案中，所述亲本Cas蛋白是核酸酶，即切割靶双螺旋核酸(例如，双螺旋DNA)的两条链。在一些实施方案中，所述亲本Cas蛋白是切口酶，即切割靶双螺旋核酸(例如，双螺旋DNA)的单链。
[0017]在一些实施方案中，所述亲本Cas蛋白为天然野生型Cas蛋白；在其他的实施方式中，所述亲本Cas蛋白为经过工程化改造后的Cas蛋白。
[0018]本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本专利技术的范围内。因此，本专利技术的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本专利技术也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本专利技术的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第100位；优选的，所述第100位氨基酸突变为K，Y，M，F，R，W，S，H，V，I，N，C，L中的任意一种。2.根据权利要求1所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述亲本Cas蛋白为Cas12j家族蛋白。3.根据权利要求2所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述亲本Cas蛋白为Cas12j19蛋白。4.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1
‑
3任一所述的Cas突变蛋白以及其他的修饰部分；优选的，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测的标记或其任意组合；更优选的，所述修饰部分选自表位标签、报告基因序列、核定位信号(NLS)序列、靶向部分、转录激活结构域、转录抑制结构域、核酸酶结构域；更优选的，所述修饰部分选自具有下列的活性的结构域：核苷酸脱氨酶，腺苷脱氨酶，胞苷脱氨酶，甲基化酶活性,去甲基化酶,转录激活活性,转录抑制活性,转录释放因子活性,组蛋白修饰活性,核酸酶活性,单链RNA切割活性,双链RNA切割活性,单链DNA切割活性,双链DNA切割活性和核酸结合活性。5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1
‑
3任一所述Cas突变蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求4所述融合蛋白的多核苷酸序列。6.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。7.一种CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1
‑
3任一所述的Cas突变蛋白以及至少一种gRNA；所述gRNA能够结合权利要求1
‑
3任一所述的Cas突变蛋白；优选的，所述gRNA从5
’
至3
’
方向包含与所述Cas突变蛋白结合的序列和靶向靶序列的引导序列。8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1
‑
3任一所述的Cas突变蛋白或权利要求4所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其为gRNA，所述gRNA能够结合权利要求1
‑
3任一所述的Cas突变蛋白；优选的，所述gRNA从5
’
至3
’
方向包含与所述Cas突变蛋白结合的序列和靶向靶序列的引导序列；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。9.一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1
‑
3任一所述的Cas突变蛋白或权利要求4所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其为gRNA，所述gRNA包括能够结合权利要求1
‑
3任一所述的Cas突变蛋白的同向重复序列和能够靶向靶序列的引导序列；优选的，所述gRNA从5
’
至3
’
方向包含与所述Cas突变蛋白结合的序列和靶向靶序列的引导序列；(iii)...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：