融合蛋白及其在基因编辑中的应用制造技术

本发明专利技术公开了融合蛋白及其在基因编辑中的应用。具体地公开了提高基因编辑效率的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.13的蛋白质。本发明专利技术还提供了基因编辑系统和提高Cas12i3蛋白介导的基因编辑效率的方法。本发明专利技术通过筛选获得了可显著提高Cas酶编辑效率的T5核酸外切酶和linker编码序列核酸分子组合。按照该组合方式得到的融合蛋白比未改造的Cas12i3蛋白编辑效率显著提高。进一步流式分析结果显示，经过C

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白及其在基因编辑中的应用


[0001]本专利技术属于基因编辑工程领域，涉及融合蛋白及其在基因编辑中的应用，具体涉及编码T5核酸外切酶和linker的核酸分子组合及其应用。

技术介绍

[0002]核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3
’
，5
’‑
磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。T5核酸外切酶(T5 exonuclease，简称T5 exo)来源于T5噬菌体，该酶按照5
’→3’
方向降解双链或单链DNA。
[0003]CRISPR/Cas是原核生物抵御病毒感染或噬菌体入侵产生的一种适应性免疫系统。其中II型CRISPR/Cas9系统和V型系统(如CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas12b等)组成简单，操作简便，在基因编辑中得到广泛应用。CRISPR/Cas9系统通过单向导RNA(single guide RNA，sgRNA)识别DNA靶标之后，Cas9通常会产生双链断裂。然后细胞会通过非同源末端连接机制和同源重组修复机制修复双链断裂，从而产生插入、缺失或者在有供体模板时产生基因插入和特定碱基改变。目前CRISPR/Cas9技术已广泛应用于微生物、动植物等诸多物种，CRISPR/Cas系统打破了传统育种的局限性，加快了动植物遗传改良进程。
[0004]中国专利技术专利CN111757889B中公开了一种Cas蛋白Cas12f.4，在本文中将其称为Cas12i3。该Cas蛋白可以在真核生物中进行编辑。Cas12i3蛋白的切割位点位于PAM的下游的15nt和22nt处，切割后产生7nt的5
’
悬垂，该悬垂互补配对，导致细胞修复时偏向准确修复断裂，降低编辑效率。因此，有必要进一步改进CRISPR/Cas12i3基因编辑系统，提高其编辑效率，开发更高效的基因编辑系统，使其在基因编辑、基因功能研究、动植物遗传改良等领域具有更广泛的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何提高Cas12i3蛋白介导的基因编辑的效率。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了提高基因编辑效率的融合蛋白，所述融合蛋白可为下述任一种：
[0007]A1)氨基酸序列是SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13的蛋白质；
[0008]A2)将SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0009]A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0010]本文所述取代可为保守性取代(也称为保守性替换)或非核心功能区的非保守性取代。本领域技术人员所公知，保守性取代或是在非核心功能区进行非保守取代，对蛋白质
的功能通常不会产生质的影响。
[0011]本文所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His
‑
tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
[0012]本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0013]本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
[0014]本专利技术还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：
[0015]B1)编码本文任一所述融合蛋白的核酸分子；
[0016]B2)编码序列是SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示的DNA分子；
[0017]B3)核苷酸序列是SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示的DNA分子。
[0018]所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0019]本专利技术还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
[0020]C1)含有所述核酸分子的表达盒；
[0021]C2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；
[0022]C3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；
[0023]C4)含有所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有C1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有C2)所述重组载体的重组宿主细胞。
[0024]进一步地，C1)所述表达盒、C2)所述重组载体、C3)所述重组微生物和C4)所述重组宿主细胞均可表达所述核酸分子。
[0025]本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)等但不限于此。所述真菌可为酵母，所述酵母可来自酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属等但不限于此。所述放线菌可来自链霉菌属(Streptomyces sp.)、诺卡菌属(Nocardia sp.)、小单孢菌属(Micromonospora sp.)等但不限于此。所述藻类可来自墨角藻属(Fucus sp.)、曲壳藻属(Achnanthes sp.)等但不限于此。所述病毒可为轮状病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒等但不限于此。
[0026]本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为下述任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13的蛋白质；A2)将SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：B1)编码权利要求1所述融合蛋白的核酸分子；B2)编码序列是SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示的DNA分子；B3)核苷酸序列是SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示的DNA分子。3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：C1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；C2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；C3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；C4)含有权利要求2所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有C1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有C2)所述重组载体的重组宿主细胞。4.权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3所述生物材料的下述任一种应用：D1)在基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩红兵，汪林丽，艾越，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：