DNA靶向基因编辑工具的开发制造技术

DNA靶向基因编辑工具的开发。本公开内容涉及生物技术及医学领域。更具体地，本公开内容涉及新的Cas9家族蛋白、筛选新的Cas9家族蛋白的方法、以及相应的DNA编辑系统及其应用。本公开内容尤其涉及Cas9蛋白及相关的DNA编辑系统。所述新型Cas9蛋白的分子量很低，几乎将具有guide RNA引导的且具有DNase活性的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
DNA靶向基因编辑工具的开发


[0001]本公开内容涉及生物技术及医学领域。更具体地，本公开内容涉及新的Cas9家族蛋白、筛选新的Cas9家族蛋白的方法、以及相应的DNA编辑系统及其应用。本公开内容尤其涉及低分子量Cas9蛋白及相关的DNA编辑系统。

技术介绍

[0002]CRISPR
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Cas系统被称为新一代基因组工程工具的关键组件，在细菌，古细菌等微生物中起着适应性免疫机制的作用，可保护微生物免受病毒和其他外来核酸的侵害。CRISPR
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Cas免疫应答主要包括三个阶段：适应阶段、表达和加工阶段和干扰阶段。与其他防御机制类似，CRISPR
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Cas系统在与移动遗传元件不断竞争的背景下发展，这导致Cas蛋白序列和CRISPR
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Cas基因座结构的极端多样化。
[0003]自2011年以来，依据CRISPR
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Cas系统的基因组成，基因座结构以及序列相似性聚类等方法，目前可以将CRISPR
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Cas系统分成2大类，其中Class 1类系统具有由多个Cas蛋白质组成的效应器模块，其中一些形成crRNA结合复合物，这些复合物通过额外Cas蛋白来介导pre
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crRNA处理和干扰。相比之下，Class 2类系统包含一个单一的具有多功能域结合区的Cas效应蛋白，它能结合crRNA参与干扰所需的所有活动，在某些变体中，还包括参与pre
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crRNA成熟过程。目前Class 2类型CRISPR
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Cas系统1主要分3个亚型：type II(如Cas9)，type V3(如Cas12a)，和type VI 4(如Cas9d)。其中type VI效应Cas蛋白则主要靶向RNA，而type II和type V亚型主要靶向DNA。
[0004]由于Class 2类CRISPR
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Cas系统相较与Class 1类CRISPR
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Cas系统具有显著的优势，自其被发现以来，已吸引了大批学者们对它们进行了深入的研究和改造，并开发出多种依赖CRISPR
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Cas的基因操作工具，包括CRISPRa，CRISPRi，单碱基编辑技术等。利用这些工具也促进一部分学者们开始从基础研究向临床应用研究发展，特别是目前已有部分基因治疗相关药物上市，这又推进了人类的健康事业的发展。由于很多时候，基因疗法依赖于递送介质，常用的包装工具是逆转录病毒，腺病毒或者腺相关病毒等，但是它装载容量有限，如目前常用的AAV递送载体的装载量只有4.7kb，不利于分子量大的CRISPR
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Cas相关工具包装到AAV中。尽管有学者尝试采用共转多个包装不同调控原件的病毒，但是这种处理的结果远不如all
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in
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one的包装体系。
[0005]2020年有学者在大型细菌病毒噬菌体中找到了分子量只有Cas9和Cas12a基因组编辑酶的一半的Casφ(也被归为Cas12j亚家族)蛋白，它能在真核生物细胞上发挥切割DNA的功能。近期张锋团队还找到Cas9和Cas12的始祖蛋白IscB(约400个氨基酸)和TnpB家族，它们也是guide RNA依赖的核酸酶，只包含有单一核酸切割结构域(如RuvC)，这些研究结果暗示自然界中可能存在更低分子量的单效应Cas酶。然而目前尚未发现更小且高效的Cas9蛋白，因此需要开发新的数据挖掘算法来进一步探索紧凑型的CRISPR
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Cas9系统单效应蛋白，以便可以更好应用于基因治疗。
[0006]既往研究策略主要依据Cas1蛋白的序列保守型来确定临近Cas蛋白，但是这种方
式会遗漏一些不存在Cas1蛋白的单效应蛋白。依据CRISPR
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array与Cas蛋白的共存性，促使学者们直接从预测CRISPR array入手，然后寻找临近CRISPR
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Cas关联蛋白，但是受制于当前预测CRISPR array的算法局限性，并没有哪种算法被大家归为金标准。此外，候选蛋白确定问题上，主要依赖DNA和蛋白序列比对，这很容易忽略蛋白空间折叠的影响。因此，亟需开发的新的寻找自然界分子量更小的Class 2类CRISPR
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Cas9系统相关单效应蛋白的计算方法和实验验证方法。

技术实现思路

[0007]针对现有筛选新型CRISPR
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Cas蛋白技术的不足和实际需求，本公开内容提供了一种快速寻找包含RuvC和/或HNHc结构域(至少1个)的新型guide RNA引导具有DNase活性的CRISPR
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Cas9蛋白的方法并从生物信息分析层面(例如，序列比对、蛋白结构预测等)和实验层面验证了候选蛋白的DNase活性。这些蛋白潜在应用于DNA层面的编辑、调控、检测等方面，具有广阔的学术价值和商业应用价值。
[0008]本公开内容所解决的技术问题是如何快速寻找紧凑型的DNA酶切活性结构域(RuvC和HNHc)较多的候选CRISPR
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Cas9蛋白及其系统；其次是验证候选CRISPR
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Cas9蛋白及其系统的活性；并最终获得了多种新型Cas9蛋白。
[0009]本公开内容实现了以下技术效果：(1)开发了快速筛选新型Cas9家族蛋白的分析方法，该方法可以对新更新的原核微生物DNA序列和宏基因组序列进行CRIPSR array系统的分析和相关效应蛋白的筛选；(2)筛选的低分子量的Cas9家族成员，拓展CRISPR
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Cas9的应用范围。由于候选Cas9蛋白低分子量能很好的通过腺相关病毒等递送载体包装，从而实现相关疾病的诊疗，如神经相关退行性疾病的诊疗，在植物领域则可以开展育种，逆境胁迫等方面的研究，在微生物领域可以进行相关工程菌的改造等；(3)本方法在筛选过程中，除利用Cas9蛋白的已知RuvC结构域和/或HNHc结构域进行筛选外，还将其他种类的蛋白质中具备DNA切割活性的保守型结构域包括在内，从而提供了筛选新的Cas9蛋白的可能，并且由于这些新Cas9蛋白中这些新的功能结构域的鉴定，为进一步改造Cas9蛋白提供了新的思路和可能性。
[0010]在本公开内容的一个方面中，提供了Cas9蛋白。
[0011]在一个优选的实施方案中，所述Cas9蛋白包含如SEQ ID NO:1
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48中任一项所述的氨基酸序列，或具有一个或更多个残基的保守氨基酸取代的SEQ ID NO:1
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48中任一项所述的氨基酸序列。
[0012]在一个优选的实施方案中，所述Cas9蛋白的DNA切割活性被保留。
[0013]在一个优选的实施方案中，所述Cas9蛋白的RuvC和/或HNHc等DNA切割结构域经进一步修饰或改造，而使其DNA切割活性降低或消除，成为DNA切割活性降低或消除的dCas9。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Cas9蛋白，其包含如SEQ ID NO:1至42中任一项所述的氨基酸序列，或具有一个或更多个残基的保守氨基酸取代的SEQ ID NO:1至42中任一项所述的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述Cas9蛋白，其DNA切割活性被保留。3.根据权利要求1所述Cas9蛋白，其RuvC结构域和/或HNHc切割结构域经进一步修饰或改造，而使其DNA切割活性降低或消除，成为DNA切割活性降低或消除的dCas9。4.根据权利要求1至3中任一项所述的Cas9蛋白，其中所述Cas9蛋白与一个或更多个异源功能性结构域融合，其中所述融合在所述Cas9蛋白的N端、C端或者内部。5.根据权利要求4所述的Cas9蛋白，其中所述一个或更多个异源功能性结构域具有以下活性：脱氨酶如胞苷脱氨基酶和脱氧腺苷脱氨基酶、甲基化酶、去甲基化酶、转录激活、转录抑制、核酸酶、单链DNA裂解、双链DNA裂解、DNA或RNA连接酶、报告蛋白、检测蛋白、定位信号、或其任意组合。6.核酸分子，其包含编码权利要求1至5中任一项所述Cas9蛋白的核苷酸序列。7.根据权利要求6所述的核酸分子，其针对在特定宿主细胞中的表达而进行了密码子优化。8.根据权利要求7所述的核酸分子，其中所述宿主细胞是原核或真核生物细胞，优选人细胞。9.根据权利要求6至8中任一项所述的核酸分子，其包含与编码Cas9的核苷酸序列有效链接的启动子，其为组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、人工合成启动子、嵌合型启动子或发育特异性启动子。10.表达载体，其包含权利要求6至9中任一项所述核酸分子，以DNA或RNA或蛋白等形式表达权利要求1的氨基酸序列或权利要求6至9中任一项的核苷酸序列。11.根据权利要求10所述的表达载体，其为DNA、RNA、蛋白或病毒载体，其中病毒载体包括腺相关病毒(AAV)、重组腺相关病毒(rAAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯孢疹病毒、溶瘤病毒。12.递送系统，包含(1)权利要求10所述的表达载体，或权利要求6至11中任一项所述的Cas9蛋白；以及(2)递送载体。13.根据权利要求12所述的递送系统，其中所述递送载体是病毒载体、纳米颗粒、纳米脂质体颗粒(LNP)、阳离子聚合物(如PEI)、脂质体、外泌体、类病毒颗粒(VLP)，微囊泡或基因枪，其中病毒载体包括：腺相关病毒(AAV)、重组腺相关病毒(rAAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯孢疹病毒、溶瘤病毒等。14.CRISPR
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Cas系统，其包含：(1)根据权利要求1至5中任一项所述的Cas9蛋白或者其衍生物或功能片段，或权利要求6至9中任一项所述核酸分子；(2)用于靶向目标DNA的gRNA序列；(3)靶DNA。15.根据权利要求14所述的CRISPR
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Cas系统，Cas9蛋白的功能片段应指含有一个或多个SEQ ID NO:1至42中任何一个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基)的添加、缺失和/或取代(例如保守取代)。16.根据权利要求15所述的CRISPR
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Cas系统，Cas9蛋白的衍生物应指至少具有与SEQ ID NO:1至42中任意一个蛋白片段达到≥70％氨基酸序列同一性(如70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性)。
17.根据权利要求14所述的CRISPR
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Cas系统，其中所述gRNA序列包含同向重复(DR)序列，反式作用CRISPR RNA(crRNA)(简称为tracrRNA)和靶向靶DNA部分的间隔区域的序列。18.根据权利要求17所述的CRISPR
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Cas系统，其中所述DR序列为表1中所示序列；tracrRNA序列为表2中所示序列；其中所述间隔区序列为10
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【专利技术属性】
技术研发人员：周海波，许争争，冯灿斌，
申请(专利权)人：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：