【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物遗传领域。具体地说，本专利技术涉及克服着床前和着床后表观遗传障碍的体细胞核移植技术。
技术介绍
1、体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,scnt)是指通过显微操作技术将终末分化的体细胞核注射到去核的卵母细胞中，这样形成的重组胚胎最终发育成个体的技术，也称为体细胞克隆技术。体细胞细胞核拥有完整的基因组dna序列，因此体细胞核移植胚胎发育效率低的主要原因是不依赖于dna序列的表观遗传异常。
2、体细胞核移植技术能够将终末分化的体细胞重编程为具有全能性的胚胎。因此，体细胞核移植技术介导的哺乳动物克隆技术对于农业畜牧生产、濒危动物的物种保护、药物生产、疾病模型构建以及再生医学有着巨大的潜在应用价值。截止目前，已有超过20种哺乳动物被克隆出来，包括非人灵长类。然而，极低的克隆效率严重限制这一技术的应用，例如，小鼠核移植效率在不应用表观修饰手段的情况下只有1％。
3、过去的研究发现小鼠体细胞核移植胚胎中主要存在两类表观障碍。一类是着床前表观障碍导致合子基因组激活(zygotic genome activation,zga)失败，包括h3k9me3异常、h3k4me3异常以及组蛋白乙酰化异常。另一类是由h3k27me3介导的非典型母源印记丢失导致的着床后表观障碍。
4、克隆胚胎拥有与正常受精胚胎相同的dna序列。因此，克隆胚胎的发育异常大多数是由于不依赖dna序列的表观遗传缺陷造成的。之前已经有许多研究发现克隆胚胎中h3k9me3、h3k4me3和
5、体细胞核移植胚胎的着床后发育异常包括克隆胚胎的x染色体失活异常和h3k27me3母源印记丢失。在正常小鼠着床前胚胎发育过程中，xist作为x染色体失活的主要调控者，覆盖于父本的x染色体上，使其失活，而母本的x染色体则保持活性，这一x染色体失活方式称为x染色体的印记失活。然而，在克隆小鼠胚胎中xist的异常表达导致雌性胚胎中两条x染色体或者雄性胚胎中x染色体处于失活状态。在其后的研究中发现小鼠核移植胚胎中xist是由h3k27me3母源印记所调控的。已经有研究发现h3k27me3母源印记基因sfmbt2、jade1、gab1、smoc1、slc38a4和gm32885对核移植胚胎着床后发育至关重要，尤其是对克隆胎盘的发育。通过构建杂合敲除的xist供体细胞模拟正常胚胎中的xci能够显著提升小鼠核移植效率。联合过表达kdm4d和xist敲除能够将小鼠核移植效率最高提升到23.5％，但是这些克隆动物依然存在着床后发育问题，包括异常增大的胎盘，胎盘中海绵层和迷路层不规则的边界以及膨胀的海绵层细胞。然而，通过修正克隆胚胎中的h3k27me3母源印记基因sfmbt2、jade1、gab1和smoc1能够挽救异常的克隆胎盘以及将成纤维细胞的克隆效率从0％提升至14％。
6、在单个核移植胚胎中解决大多数的表观障碍依然是目前研究的难点，特别是在供体细胞中引入多个杂合敲除的h3k27me3母源印记基因从而模拟正常胚胎中h3k27me3母源印记是非常具有难度的。现有技术中克服h3k27me3印记障碍的方法是通过杂合敲除多个h3k27me3母源印记基因，这一方法依赖基因编辑可能会导致基因组的不稳定性，并且这一方法操作难度很大，需要构建单倍体胚胎干细胞以及利用四倍体补偿技术，最终获得的存活个体也非常稀少。
7、然而，如何在单个胚胎中克服目前已知的多个表观遗传障碍仍然是个难题。因此，本领域需要开发一种高效且简便的体细胞核移植技术体系。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是提供克服着床前和着床后表观遗传障碍的体细胞核移植技术。
2、在本专利技术的第一方面，提供了一种体细胞克隆非人哺乳动物制备方法，包括步骤：
3、(i)提供一体细胞核移植胚胎；
4、(ii)对所述核移植胚胎进行激活和重编程处理，培养得到经处理的胚胎；
5、(iii)从所述经处理的胚胎中分离内细胞团，与四倍体胚胎细胞聚合得到内细胞团-四倍体聚合胚胎；和
6、(iv)将所述聚合胚胎进行移植，从而获得所述体细胞克隆非人哺乳动物。
7、在另一优选例中，所述的步骤(i)中，所述体细胞核移植胚胎通过以下步骤得到：提供一正常未受精卵，将体细胞核注入所述未受精卵，培养得到所述体细胞核移植胚胎。
8、在另一优选例中，步骤(ii)中，进行激活处理的核移植胚胎处于1细胞期。
9、在另一优选例中，所述的激活为使用激活处理剂进行激活。
10、在另一优选例中，所述的激活剂包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
11、在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：tsa、scriptaid、或其组合。
12、在另一优选例中，所述激活剂中tsa浓度为0.1-50nm，优选地0.5-30nm，更优选地1-15nm，更优选地5-10nm。
13、在另一优选例中，所述的激活处理包括：使用tsa激活2-20小时，优选地6-14小时，更优选地8-10小时。
14、在另一优选例中，步骤(ii)中，进行重编程处理的核移植胚胎处于1细胞期、2细胞期、4细胞期、或8细胞期。
15、在另一优选例中，所述的重编程处理使用重编程处理剂进行。
16、在另一优选例中，所述的重编程处理剂包括：
17、(a)h3k9me3组蛋白去甲基化酶、编码其的mrna、编码其的的dna、或其组合；和/或
18、(b)h3k4me3组蛋白去甲基化酶、编码其的mrna、编码其的dna、或其组合。
19、在另一优选例中，所述的h3k9me3组蛋白去甲基化酶包括：kdm4d、kdm4b、或其组合。
20、在另一优选例中，所述的h3k4me3组蛋白去甲基化酶包括：kdm5b。
21、在另一优选例中，所述的重编程处理包括：将编码kdm4d蛋白的mrna和编码kdm5b的mrna注入所述的体细胞核移植胚胎的胚胎细胞中。
22、在另一优选例中，将102-108(较佳地104-106)拷贝/细胞的编码kdm4d蛋白的mrna注入所述核移植胚胎的细胞中。
23、在另一优选例中，将102-108(较佳地104-106)拷贝/细胞的编码kdm5b蛋白的mrna注入所述核移植胚胎的细胞中。
24、在另一优选例中，所述编码kdm4d的mrna处于一溶液中，所述mrna的浓度为50-4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种体细胞克隆非人哺乳动物制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激活为使用激活处理剂进行激活，所述的激活剂包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：TSA、Scriptaid、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重编程处理使用重编程处理剂进行，所述的重编程处理剂包括：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的H3K9me3组蛋白去甲基化酶包括：Kdm4d、Kdm4b、或其组合。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的H3K4me3组蛋白去甲基化酶包括：Kdm5b。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中所述的四倍体胚胎细胞来源于正常受精细胞。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括：
9.一种如权利要求8所述的试剂组合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于制备体细胞克隆非人哺乳动物。
10.一种体细胞克隆非
...【技术特征摘要】
1.一种体细胞克隆非人哺乳动物制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激活为使用激活处理剂进行激活，所述的激活剂包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：tsa、scriptaid、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重编程处理使用重编程处理剂进行，所述的重编程处理剂包括：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的h3k9me3组蛋白去甲基化酶包括：kdm4d、k...
【专利技术属性】
技术研发人员：李雅梅，陆发隆，孙强，刘真，
申请(专利权)人：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。