一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流的试剂盒和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种针对生物样品中含有羰基、含有羧基和含有磷酸基的多种代谢物的代谢组和代谢流分析的试剂盒及其使用方法。所述方法采用3

【技术实现步骤摘要】
一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流的试剂盒和使用方法
[0001]相关申请
[0002]本申请是申请号为202110790654.9，申请日为2021年7月13日，专利技术名称为“一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法和试剂盒”的专利技术专利申请的分案申请。


[0003]本专利技术属于分析
，具体涉及一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法以及用于该方法的试剂盒。

技术介绍

[0004]代谢研究在疾病的发生发展，分子机制及治疗新靶标的发现等方面起着至关重要的作用。代谢组学以高通量、无偏差的方式全面鉴定和量化生物系统中的内源性小分子(分子量<1,500Da)代谢物，是代谢研究的重要技术。基于液相色谱质谱联用(LC
‑
MS)技术的代谢组学分析平台因其高灵敏度、高特异性的优势已成为最主要的代谢组学分析技术。但是，由于代谢物种类繁多、理化性质多样、浓度差异大，同时，很多具有重要生物学功能的代谢物丰度或质谱检测信号极低，导致LC
‑
MS技术目前对代谢物进行全面覆盖分析仍存在重大技术挑战，成为严重制约代谢研究的瓶颈。
[0005]化学衍生化虽然可以提高代谢物的检测灵敏度，但是，一种衍生化试剂通常只能与一种功能基团发生反应，导致目前基于衍生化的代谢组学分析技术对代谢物的覆盖范围仍然非常有限。
[0006]鉴于现有的技术中检测灵敏度不足和代谢物种类覆盖少的缺点，需要开发一种能够覆盖多种代谢物、检测灵敏度高，且简单易操作的代谢组和代谢流分析的新方法。

技术实现思路

[0007]为改善上述技术问题，本专利技术提供了一种能够同时检测生物样品中多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法及应用该方法的检测试剂盒。所述的多种代谢物包含了分子结构中含有羰基的代谢物、含有羧基的代谢物和含有磷酸基的代谢物，包括但不限于有机酸类、氨基酸类、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类等代谢物。
[0008]本专利技术提供了一种可同时检测生物样品中多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法，通过以下方案实现：
[0009]采用3
‑
硝基苯肼作为衍生化试剂对生物样本中的代谢物进行衍生化反应得到代谢物衍生物，利用LC
‑
MS(液相色谱
‑
质谱联用)技术进行代谢组和代谢流分析。检测对象包括了含有羰基的、含有羧基的和含有磷酸基的多种代谢物。
[0010]根据本专利技术的实施方案，所述代谢物选自含有羰基的代谢物、含有羧基的代谢物和含有磷酸基的代谢物中的至少一种；优选为含磷酸基的代谢物，即分子结构中包含一个或多个磷酸基团的代谢物。
[0011]根据本专利技术的实施方案，所述含磷酸基的代谢物可选自1,3
‑
二磷酸甘油酸、1
‑
磷
酸半乳糖、1
‑
磷酸二氢鞘氨醇、1
‑
磷酸葡萄糖、2,3
‑
二磷酸甘油酸、2
’
,3
’‑
二脱氧腺苷
‑5‑
三磷酸、2
‑
磷酸甘油酸、2
‑
硬脂酰甘油磷酸甘油、3
’‑
腺苷单磷酸、3
‑
磷酸甘油、3
‑
磷酸甘油醛、3
‑
磷酸甘油酸、5
‑
氟脱氧尿苷单磷酸、5
’‑
磷酸吡哆胺、5
’‑
磷酸吡哆醇、5
’‑
磷酸吡哆醛、5
’‑
磷酸核糖基
‑5‑
氨基
‑4‑
咪唑甲酰胺、5
‑
胸苷酸、6
‑
甲基巯鸟苷单磷酸、6
‑
甲基巯嘌呤
‑5’‑
单磷酸核糖核苷酸、6
‑
磷酸甘露糖、6
‑
磷酸果糖、6
‑
磷酸葡萄糖酸、6
‑
磷酸山梨醇、6
‑
巯黄嘌呤
‑5’‑
单磷酸、6
‑
巯肌苷三磷酸、6
‑
巯鸟苷单磷酸、6
‑
巯鸟苷酸、6
‑
巯基肌苷
‑5’‑
单磷酸、6
‑
巯基嘌呤核糖核苷
‑5’‑
二磷酸、6
‑
巯基嘌呤核糖核苷三磷酸、N
‑
乙酰氨基葡萄糖
‑1‑
磷酸、N
‑
乙酰
‑
氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸、N
‑
乙酰神经氨酸
‑9‑
磷酸、O
‑
磷酸酪氨酸、O
‑
磷酸丝氨酸、O
‑
磷酸苏氨酸、O
‑
磷酸乙醇胺、1
‑
(5
’‑
磷酸核糖)
‑4‑
(N
‑
琥珀酰甲酰胺)
‑5‑
氨基咪唑、β
‑
甘油磷酸、氨基甲酰磷酸、胞苷2
’
,3
’‑
环磷酸、胞苷
‑3’‑
单磷酸、胞苷单磷酸、二磷酸胞苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、法尼焦磷酸、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸甘油、甘油磷酸肌醇、甘油磷酰乙醇胺、钴胺素、果糖
‑
1,6
‑
二磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、核糖
‑5‑
磷酸、核酮糖
‑5‑
磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、肌醇
‑1‑
磷酸、肌苷酸、甲钴胺、景天庚酮糖
‑7‑
磷酸、磷酸二甲酯、磷酸二羟丙酮、磷酸二乙酯、磷酸核糖焦磷酸、磷酸肌醇、磷酸肌酸、磷酸甲酯、磷酸丝氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸腺苷、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、硫胺素单磷酸、硫胺素焦磷酸、巯黄嘌呤单磷酸、巯鸟苷
‑5’‑
二磷酸、巯鸟苷
‑5’‑
三磷酸、六磷酸二腺苷、六磷酸肌醇、鸟苷
‑2’
,3
’‑
环磷酸、鸟苷
‑3’
,5
’‑
环磷酸、鸟苷三磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷
‑2’
,3
’‑
环磷酸、尿苷
‑3’‑
单磷酸、尿苷
‑5’‑
单磷酸、尿苷
‑5’‑
二磷酸、尿苷二磷酸
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、葡萄糖
‑
1,6
‑
二磷酸、葡萄糖
‑6‑
磷酸、氰钴胺、三磷酸二腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸腺苷、四磷酸二腺苷、天冬氨酰
‑4‑
磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿甘二磷酸、脱氧腺苷单磷酸、五磷酸二腺苷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，包括反应装置、代谢物标准品干燥固体粉末和衍生化试剂包；所述衍生化试剂包包含3
‑
硝基苯肼干燥固体粉末、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺干燥固体粉末和吡啶
‑
甲醇溶液；所述反应装置可以是适用于LC
‑
MS检测的市售48孔板或96孔板；所述代谢物标准品干燥固体粉末为将代谢物标准品混合溶液等量分装成若干份后冷冻干燥得到的粉末；所述试剂盒能够用于同时检测生物样品中多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法，其中，采用3
‑
硝基苯肼作为衍生化试剂对生物样本中的代谢物进行衍生化后利用LC
‑
MS(液相色谱
‑
质谱联用)技术进行代谢组和代谢流分析。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述衍生化试剂包包含3
‑
硝基苯肼干燥固体粉末、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺的干燥固体粉末和吡啶
‑
甲醇溶液；优选地，所述吡啶
‑
甲醇溶液中吡啶含量为0.1
‑
2％(v/v)，优选含量为0.5％(v/v)；优选地，所述代谢物标准品选自有机酸类、氨基酸类、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类代谢物中的至少一种；优选地，所述代谢物标准品选自如下所述的成分：1,3
‑
二磷酸甘油酸、1
‑
磷酸半乳糖、1
‑
磷酸二氢鞘氨醇、1
‑
磷酸葡萄糖、2,3
‑
二磷酸甘油酸、2
’
,3
’‑
二脱氧腺苷
‑5‑
三磷酸、2
‑
磷酸甘油酸、2
‑
硬脂酰甘油磷酸甘油、3
’‑
腺苷单磷酸、3
‑
磷酸甘油、3
‑
磷酸甘油醛、3
‑
磷酸甘油酸、5
‑
氟脱氧尿苷单磷酸、5
’‑
磷酸吡哆胺、5
’‑
磷酸吡哆醇、5
’‑
磷酸吡哆醛、5
’‑
磷酸核糖基
‑5‑
氨基
‑4‑
咪唑甲酰胺、5
‑
胸苷酸、6
‑
甲基巯鸟苷单磷酸、6
‑
甲基巯嘌呤
‑5’‑
单磷酸核糖核苷酸、6
‑
磷酸甘露糖、6
‑
磷酸果糖、6
‑
磷酸葡萄糖酸、6
‑
磷酸山梨醇、6
‑
巯黄嘌呤
‑5’‑
单磷酸、6
‑
巯肌苷三磷酸、6
‑
巯鸟苷单磷酸、6
‑
巯鸟苷酸、6
‑
巯基肌苷
‑5’‑
单磷酸、6
‑
巯基嘌呤核糖核苷
‑5’‑
二磷酸、6
‑
巯基嘌呤核糖核苷三磷酸、N
‑
乙酰氨基葡萄糖
‑1‑
磷酸、N
‑
乙酰
‑
氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸、N
‑
乙酰神经氨酸
‑9‑
磷酸、O
‑
磷酸酪氨酸、O
‑
磷酸丝氨酸、O
‑
磷酸苏氨酸、O
‑
磷酸乙醇胺、1
‑
(5
’‑
磷酸核糖)
‑4‑
(N
‑
琥珀酰甲酰胺)
‑5‑
氨基咪唑、β
‑
甘油磷酸、氨基甲酰磷酸、胞苷2
’
,3
’‑
环磷酸、胞苷
‑3’‑
单磷酸、胞苷单磷酸、二磷酸胞苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、法尼焦磷酸、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸甘油、甘油磷酸肌醇、甘油磷酰乙醇胺、钴胺素、果糖
‑
1,6
‑
二磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、核糖
‑5‑
磷酸、核酮糖
‑5‑
磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、肌醇
‑1‑
磷酸、肌苷酸、甲钴胺、景天庚酮糖
‑7‑
磷酸、磷酸二甲酯、磷酸二羟丙酮、磷酸二乙酯、磷酸核糖焦磷酸、磷酸肌醇、磷酸肌酸、磷酸甲酯、磷酸丝氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸腺苷、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、硫胺素单磷酸、硫胺素焦磷酸、巯黄嘌呤单磷酸、巯鸟苷
‑5’‑
二磷酸、巯鸟苷
‑5’‑
三磷酸、六磷酸二腺苷、六磷酸肌醇、鸟苷
‑2’
,3
’‑
环磷酸、鸟苷
‑3’
,5
’‑
环磷酸、鸟苷三磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷
‑2’
,3
’‑
环磷酸、尿苷
‑3’‑
单磷酸、尿苷
‑5’‑
单磷酸、尿苷
‑5’‑
二磷酸、尿苷二磷酸
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、葡萄糖
‑
1,6
‑
二磷酸、葡萄糖
‑6‑
磷酸、氰钴胺、三磷酸二腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸腺苷、四磷酸二腺苷、天冬氨酰
‑4‑
磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿甘二磷酸、脱氧腺苷单磷酸、五磷酸二腺苷、腺苷
‑2’
,3
’‑
环磷酸、腺苷
‑3’
,5
’‑
环磷酸、烟酰胺核糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、脱氧胞苷一磷酸、1
‑
磷酸鞘氨醇、1
‑
磷酸鞘氨醇(d16:1
‑
P)、1
‑
磷酸鞘氨醇(d19:1
‑
P)、1
‑
硬脂酰甘油磷酸甘油、1
‑
硬脂酰甘油磷酸丝氨
酸、木酮糖
‑5‑
磷酸、赤藓糖
‑4‑
磷酸、氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸、尿苷二磷酸
‑
葡萄糖醛酸、6
‑
磷酸葡萄糖酸
‑
D
‑
内酯、乳清酸、1
‑
磷酸核糖、6
‑
磷酸肌醇、腺苷
‑3’
,5
’‑
二磷酸、甘油磷酸、α
‑
酮戊二酸、柠檬酸、富马酸、异柠檬酸、乳酸、马来酸、丙酮酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的分析方法采用衍生化试剂特异性碎片离子作为定量离子对涉及的代谢物进行代谢流检测和分析；优选地，所述生物样品选自哺乳动物的尿液、血液、脑脊液、组织、细胞、唾液和粪便样本；优选地，所述代谢物选自有机酸类、氨基酸类、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类代谢物中的至少一种；优选地，所述衍生化反应中还可以加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺作为偶联剂。优选地，所述衍生化反应中还可以加入碱作为催化剂，所述碱为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N
‑
二甲氨基吡啶中的至少一种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中的分析方法包括以下步骤：(A)衍生化反应：向代谢物提取液中加入相同体积3
‑
硝基苯肼的溶液，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺的溶液和碱溶液，混合均匀，待反应完后，得到代谢物衍生物；(B)代谢组分析：利用LC
‑
MS技术，检测3
‑
硝基苯肼衍生化后的代谢物；(C)代谢流分析：在LC
‑
MS数据采集时，选择衍生化试剂特异性碎片离子作为代谢物衍生物的定量离子；优选地，步骤(A)中所述溶液使用的溶剂为有机溶剂，例如醇类溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种；优选地，步骤(A)中所述碱为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N
‑
二甲氨基吡啶中的至少一种；所示碱溶液可以为碱的醇溶液，所述醇可以为甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，分析方法包括以下步骤：(A1)收集生物样本；(A2)将生物样本用80％(v/v)甲醇

【专利技术属性】
技术研发人员：胡泽平，孟祥骏，庞欢欢，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：