新的癌基因、从其衍生的重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术从人中鉴定了一个新的癌基因的全部核苷酸序列，该癌基因直接参与了例如由ＨＰＶ感染宫颈上皮细胞而诱导的宫颈癌的癌变机制，并鉴定了由该癌基因编码的致癌蛋白的氨基酸序列，还提供了编码衍生自新癌基因的致癌蛋白肽链的全长多核苷酸，可用于致癌蛋白的重组生产，并提供了由此重组生产的致癌蛋白的肽链。具体来说，本发明专利技术提供了来自人的参与了宫颈癌的发生的新的癌基因多核苷酸，其中含有编码氨基酸序列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１的核苷酸序列，尤其是ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２的核苷酸序列的多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的来自人的癌基因，该癌基因参与了人宫颈癌 的发生，以及从该癌基因衍生的重组蛋白及其在医学应用中的用途。
技术介绍
已有许多文献报道了染色体的不稳定性与癌症的发生相关。此外， 最近已经报道，在控制细胞周期中G2/M期检查点的分子的缺陷导致了 染色体的不稳定。然而，因为在许多癌细胞中，在细胞中控制检査点 的分子的基因缺陷并不能被经常地观察到，因此诱导染色体不稳定的 机理从许多方面来说尚不清楚，所述染色体不稳定性与癌症的发生有 着至关重要的关系。宫颈癌的发生中包括了人乳头瘤病毒(HPV)如HPV-16或HPV-18型的感染，这一点已经广为人知。在宫颈癌组织中，已经观察到的HPV 感染的频率在90%或者以上。在由HPV感染诱导的宫颈癌的发生机理 中，病毒的E6和E7基因产物扮演了重要的角色。具体来说，已经知 道E6加速了 p53肿瘤抑制蛋白降解的过程，而E7阻断了 Rb基因的产 物pRB(成视网膜细胞瘤)肿瘤抑制蛋白的抑癌活性，这两个步骤造成了 肿瘤发生。但是，被HPV感染激活的特异性的致癌蛋白还未被鉴别。 尤其是E6和E7， HPV的病毒基因产物，诱导了染色体的不稳定性并 使细胞癌变(Carcedze),但是与其直接相关的机理的详细情况在许多方 面还基本上是未知的。因此，为了能够治疗宫颈癌，鉴别出作为HPV的耙的致癌蛋白及编码它的癌基因是非常重要的。宫颈癌是从癌前期 状态，即发育异常(宫颈鳞状上皮细胞的发育异常)发展为侵入性的癌 症。在某些情况下，疾病可以保持在发育异常阶段而不发展为癌症。 在另一方面，也有相当多情况下，发育异常可以很快地发展为晚期癌 症。鉴于这样的情况，进行更精确的癌症诊断以鉴别与宫颈癌发生直 接相关的分子，可能是非常重要的。
技术实现思路
如上所述，在HPV感染宫颈上皮细胞、经过一种癌前期状态、即 发育异常诱导侵入性癌症发生的过程中，其直接的起源应该被认为是这样一种机制，即抑制一些癌基因的表达的p53肿瘤抑制蛋白或pBR 肿瘤抑制蛋白的表达抑制活性被破坏了，并且这种破坏导致癌基因进 入了高水平表达的状态。因此，必须首先鉴别癌基因的完整的核苷酸 序列及其编码的致癌蛋白，这将开辟一条道路，以发展一些手段，用 于抑制致癌蛋白的生物化学功能，并且进一步用于阻断由致癌蛋白推 进的癌变的机制。此外，鉴定癌基因的完整的核苷酸序列及其编码的致癌蛋白的氨 基酸序列，可以允许我们生产核酸探针以检测从癌基因转录的mRNA 的表达，或者利用其重组致癌蛋白产生针对致癌蛋白的特异性抗体。 换句话说，它使我们可以开发出利用核酸探针或特异性抗体的诊断方 法，用于诊断在子宫颈中经由HPV感染引起的癌前期状态、即发育异 常发展到侵入性癌症的过程中的早期阶段。为了解决上面的问题，本专利技术的一个目标是鉴别一个来自人类的新 的癌基因的完整核苷酸序列及其编码的致癌蛋白的氨基酸序列，它们 在例如由HPV感染宫颈上皮细胞导致的宫颈癌中直接参与了癌变的机 制，此外本专利技术还提供了编码癌基因蛋白的肽链的全长多核苷酸，所 述全长多核苷酸衍生自新的癌基因，可用于重组生产致癌蛋白，并提 供由其重组生产的致癌蛋白的肽链。为了解决上面的问题我们进行了广泛的研究，最后发现并克隆了 一个基因，它在宫颈癌细胞中当向其中加入环境激素时表达增加。我 们的结论是，这个克隆的基因是一个癌基因，这是因为(1) 该基因在癌细胞中高度表达；(2) 宫颈癌由HPV感染引起，并且将E6和E7基因从HPV转 导到细胞中表达E6和E7蛋白能够增加所述基因的表达；(3) p53蛋白抑制所述基因启动子区的活性；(4) p53蛋白的缺失或突变在事实上参与了宫颈癌的发生；(5) 所述基因的表达可以由一个双链的干扰短链RNA(siRNA) 所抑制以阻止肿瘤的生长，并且在经过进一步的研究后，完成了本发 明。因此，根据本专利技术的癌基因多核苷酸是一个衍生自人的、参与了 宫颈癌发生的新的癌基因多核苷酸，它包含了编码氨基酸序列 SEQ.ID.No.l的核苷酸序列。尤其是，它是一个多核苷酸，其中编码氨 基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列是SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序 列。本专利技术还-提供了在上述根据的本专利技术的癌基因多核苷酸的基础 上，通过重组生产的肽或其盐。具体来说，本专利技术的重组肽是重组肽 或其盐，含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l或其部分氨基酸序列。尤其是， 它可以是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的重组致癌蛋白。本专利技术还提供 了一个重组载体，含有编码重组肽的多核苷酸，可用于制备该重组肽。 例如，当目标是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的本专利技术的重组致癌蛋白 时，所述重组载体就是含有癌基因多核苷酸的重组载体，所述癌基因 多核苷酸含有编码氨基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列，尤其是含有 一个多核苷酸，其中编码氨基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列是 SEQ.ID.No.2。本专利技术还提供了使用所述重组载体转化宿主细胞后产生的转化细 胞；例如，使用针对本专利技术的所述重组致癌蛋白的重组载体转化宿主 细胞而产生的转化细胞。因此，生产本专利技术的重组肽或其盐的过程是 一个生产从本专利技术的癌基因衍生出的重组肽或其盐的的过程，包括下 列步骤培养上述的转化细胞使得转化细胞生产本专利技术的重组肽；以及收集从培养物中产生的重组肽。尤其是在优选情况下，它可以是 一个包含下列步骤的生产本专利技术的重组致癌蛋白的过程培养所述转化细胞，其中已经转化了全长的基因DNA以使转化细 胞生产本专利技术的重组致癌蛋白；以及收集从培养物中产生的重组致癌蛋白。利用上述的本专利技术的重组肽，本专利技术提供了一个抗体的专利技术，它 是使用重组肽作为免疫原而产生的特异性抗体。例如，本专利技术的抗体 可以是一个对氨基酸序列SEQ.ID.No.l中623到1185区域的部分氨基 酸序列表现出特异反应性的抗体。此外，本专利技术提供了一个含有所述特异性抗体的抗体试剂盒以进 行抗原-抗体反应，用于检测含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白 或从致癌蛋白衍生的肽片段。此外，本专利技术提供了一个含有本专利技术的 特异性抗体的诊断试剂盒，用于通过抗原抗体反应检测含有氨基酸序 列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白或从致癌蛋白衍生的肽片段。本专利技术还提供了一个反义多核苷酸，含有与核苷酸序列 SEQ.ID.No.2中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列，它是一个具有至 少一段选自15到300碱基区域的DNA片段。此外，就根据本专利技术的 探针杂交试剂盒而言，还提供了一个含有上述反义多核苷酸作为DNA 探针的探针杂交试剂盒，可用于检测含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2、其 部分核苷酸序列的mRNA或由mRNA制备的cDNA。此外，本专利技术还 提供了一个含有所述反义多核苷酸作为杂交探针的诊断试剂盒，通过探针杂交的方法，用于检测含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的 表达，该mRNA被翻译为含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白。在另一方面，本专利技术还提供了一个引物对，用于对含有核苷酸序 列SEQ.ID.No.2的cDNA进行PCR扩增，引物对由如下核苷酸序列组成5' -TTGGATCC ATGAC ATCC AGATTTGGG AA AAC AT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双链的短链干扰ＲＮＡ，其能够抑制含有核苷酸序列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２的ｍＲＮＡ在宫颈癌细胞中的表达，其中ｓｉＲＮＡ的核苷酸序列为：ＣＧＧＡＣＴＡＣＣＣＴＴＡＧＣＡＣＡＡ。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐藤彰，黑田雅彦，
申请(专利权)人：日本电气株式会社，黑田雅彦，
类型：发明
国别省市：JP[日本]