包含非天然核苷酸的多核苷酸的逆转录制造技术

本文公开了逆转录包含非天然核糖核苷酸的多核苷酸的方法，所述方法包括在存在包含非天然核碱基的非天然dNTP的情况下用逆转录酶逆转录所述多核苷酸，其中所述逆转录酶使其中掺入了所述非天然NTP的cDNA聚合。在一些实施方案中，所述多核苷酸以小于或等于约500nM的浓度存在，和/或所述多核苷酸是tRNA、mRNA、RNA适配体、或多种RNA适配体侯选物的成员。或多种RNA适配体侯选物的成员。或多种RNA适配体侯选物的成员。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含非天然核苷酸的多核苷酸的逆转录
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年10月23日提交的美国临时专利申请号63/104,785的权益，将其通过引用以其整体并入本文以用于所有目的。关于联邦资助研究的声明
[0002]本专利技术是在由美国国立卫生研究院授予的授权号GM118178下在美国政府支持下完成的。政府拥有本专利技术中的某些权利。序列表[0001.1]本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2021年10月22日创建的所述ASCII副本命名为36271
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812_601_SL.txt并且大小为12,499字节。
技术介绍
和
技术实现思路

[0003]61个有义密码子/20个氨基酸遗传密码在其发现后被认为在所有生物体中是不变的、保守的。然而，深入的表征揭示了出乎意料的可塑性，其中密码子分配改变，甚至在极少数情况下扩展到包含非经典氨基酸(ncAA)硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸。(Yuan,J.等人FEBS Lett.2010,584,342
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349；Hao,B.等人Science 2002,296,1462
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1466；Kryukov,G.V.等人Science 2003,300,1439
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1443.)所有这些改变都是由天然密码子的重新分配引起的，并且类似的策略构成了重要努力的基础，所述重要努力是通过利用终止密码子和重新编码的阻抑tRNA/氨酰基tRNA合成酶(aaRS)的正交对来扩展密码子以包含目的ncAA。(Xiao,H.等人Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2016,8；Wang,L.等人Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.2006,35,225
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249.)这些重新分配策略的替代方案是经由开发非天然碱基对(UBP)来聚焦于创造新的密码子。(Malyshev,D.A.等人,Nature 2014,509,385
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388；Zhang,Y.等人Nature 2017,551,644
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647.)最值得注意的是，包括(d)NaM
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(d)TPT3 UBP(图1)在内的若干种UBP已被用于创建基于大肠杆菌(E.coli)的半合成生物体(SSO)，所述半合成生物体在其DNA中保留UBP，将它们转录至mRNA和tRNA中，并且当与用ncAA选择性地氨基酰化携带非天然反密码子的tRNA的aaRS一起提供时，利用它们翻译含有ncAA的蛋白质。
[0004]虽然(d)NaM
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(d)TPT3 UBP能够产生非天然蛋白质，但掺入ncAA的效率取决于其序列背景，使得一些密码子比其他密码子更高效。通过检查序列背景，已经鉴定出许多密码子，所述密码子被有效地复制为DNA，然后被有效地转录为RNA并在核糖体上解码。(Fischer,E.C.等人Nat.Chem.Biol.2020,16,570
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576.)由于对于在SSO的DNA中UBP的保留的测定是可用的，因此了解到几个效率较低的密码子的保真度降低是由较差的转录或较差的翻译引起的。然而，缺乏用于测量转录保真度的测定妨碍了对影响保真度的特定步骤的鉴定。此外，虽然清楚地知道不同的DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和大肠杆菌核糖体能够有效地识别UBP，但介导唯一其他常见的DNA/RNA转换的逆转录酶的能力尚未得到充分探索，并且唯一可用的数据表明它们可能无法有效地识别UBP。(Eggert等人,Towards Reverse Transcription with an Expanded Genetic Alphabet.Chembiochem2019,20,1642
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1645.)因此，需要用于逆转录包含非天然核苷酸的多核苷酸的方法以及可以测定转录和逆
转录的保真度的方法，后一种方法使得SSO ncAA掺入蛋白质中的保真度可以被理解为与转录和翻译的相对贡献有关。
[0005]此外，RNA寡核苷酸可以作为识别特定靶标(例如，用于抑制或检测靶标的目的)的适配体发挥作用。然而，从寡核苷酸文库(具有不同核苷酸序列的寡核苷酸的大型混合物)筛选和选择RNA适配体通常涉及将RNA转化为cDNA的逆转录步骤。因此，为了开发包含非天然核苷酸的RNA适配体，还需要逆转录包含非天然核酸的RNA的方法。
[0006]因此，提供了以下实施方案。实施方案1是一种逆转录包含非天然核糖核苷酸的多核苷酸的方法，所述方法包括在存在包含非天然核碱基的非天然dNTP的情况下用逆转录酶逆转录所述多核苷酸，其中所述逆转录酶使cDNA聚合，所述非天然dNTP作为非天然核苷酸掺入所述cDNA中。
[0007]实施方案2是实施方案1所述的方法，其中：所述多核苷酸以小于或等于约500nM的浓度存在。
[0008]实施方案2.1是前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶是SuperScript III。
[0009]实施方案2.2是前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述非天然dNTP不是dTPT3TP。
[0010]实施方案2.3是前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用识别所述非天然核苷酸的结合配偶体测量所述cDNA中的所述非天然核苷酸的量。
[0011]实施方案2.4是前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶产生全长cDNA，并且至少25％的所述全长cDNA包含所述非天然核苷酸。
[0012]实施方案2.5是前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是tRNA、mRNA、RNA适配体、或多种RNA适配体侯选物的成员。
[0013]实施方案3是前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA，任选地其中所述RNA是mRNA或tRNA。
[0014]实施方案4是实施方案1
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3中任一项所述的方法，所述方法进一步包括测量所述cDNA中的所述非天然核苷酸的量。
[0015]实施方案5是一种测量非天然核苷酸的掺入的方法，所述方法包括：a.在存在包含第一非天然核碱基的非天然NTP的情况下用RNA聚合酶转录包含非天然脱氧核糖核苷酸的多核苷酸以产生包含第一非天然核苷酸的RNA；b.在存在包含第二非天然核碱基的非天然dNTP的情况下用逆转录酶逆转录所述RNA，其中所述逆转录酶使cDNA聚合，所述非天然NTP作为第二非天然核苷酸掺入所述cDNA中；以及c.测量所述cDNA中的所述第二非天然核苷酸的量。
[0016]实施方案5.1是实施方案5所述的方法，所述方法是测量转录和逆转录的组合保真度的方法。
[0017]实施方案5.2是实施方案5所述的方法，所述方法是测量在转录和逆转录期间非天然核苷酸的保留的方法。
[0018]实施方案6是实施方案5
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5.2中任一项所述的方法，其中所述转录步骤是在体内进
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种逆转录包含非天然核糖核苷酸的多核苷酸的方法，所述方法包括在存在包含非天然核碱基的非天然dNTP的情况下用逆转录酶逆转录所述多核苷酸，其中所述逆转录酶使cDNA聚合，所述非天然dNTP作为非天然核苷酸掺入所述cDNA中。2.根据权利要求1所述的方法，其中：(a)所述多核苷酸以小于或等于约500nM的浓度存在；(b)所述逆转录酶是SuperScript III；(c)所述非天然dNTP不是dTPT3TP；(d)所述方法进一步包括使用识别所述非天然核苷酸的结合配偶体测量所述cDNA中的所述非天然核苷酸的量；(e)所述逆转录酶产生全长cDNA，并且至少25％的所述全长cDNA包含所述非天然核苷酸；和/或(f)所述多核苷酸是tRNA、mRNA、RNA适配体、或多种RNA适配体侯选物的成员。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA，任选地其中所述RNA是mRNA或tRNA。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，所述方法进一步包括测量所述cDNA中的所述非天然核苷酸的量。5.一种测量非天然核苷酸的掺入的方法，所述方法包括：a.在存在包含第一非天然核碱基的非天然NTP的情况下用RNA聚合酶转录包含非天然脱氧核糖核苷酸的多核苷酸以产生包含第一非天然核苷酸的RNA；b.在存在包含第二非天然核碱基的非天然dNTP的情况下用逆转录酶逆转录所述RNA，其中所述逆转录酶使cDNA聚合，所述非天然NTP作为第二非天然核苷酸掺入所述cDNA中；以及c.测量所述cDNA中的所述第二非天然核苷酸的量。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录步骤是在体内进行的。7.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述转录步骤是在原核生物或细菌中进行的。8.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述转录步骤是在大肠杆菌(E.coli)中进行的。9.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录步骤是在体外进行的。10.根据权利要求5
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9中任一项所述的方法，其中所述cDNA分子中的所述第二非天然核苷酸的量是相对于转录前所述多核苷酸中的所述非天然脱氧核糖核苷酸的量进行测量的。11.根据权利要求5
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10中任一项所述的方法，其中所述测量包括：a.在转录前对所述多核苷酸进行生物素移位测定以测定转录前含有所述非天然核苷酸的多核苷酸的比例；以及b.对所述cDNA进行生物素移位测定以测定含有所述非天然核苷酸的cDNA的比例。12.根据权利要求4
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10中任一项所述的方法，其中所述cDNA中的所述非天然核苷酸或所述第二非天然核苷酸的量是使用结合非天然核碱基的结合配偶体测量的。13.根据权利要求4
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10中任一项所述的方法，其中测量所述cDNA中的所述非天然核苷酸或所述第二非天然核苷酸的量包括凝胶移位测定或生物素移位测定。
14.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述生物素移位测定包括：a.在存在与所述cDNA中的所述非天然核苷酸配对的包含生物素化核碱基的非天然dNTP的情况下扩增所述cDNA；b.将包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物与不包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物分离；以及c.测量包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物和不包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物的量，或包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物与不包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物的比率，或含有所述非天然核苷酸的cDNA的比例。15.根据前一项权利要求所述的方法，其中将包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物与不包含所述生物素化核碱基的DNA扩增产物分离包括凝胶电泳，任选地其中所述凝胶电泳是聚丙烯酰胺凝胶电泳。16.根据权利要求14
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15中任一项所述的方法，其中将包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物与不包含所述生物素化核苷酸的DNA扩增产物分离包括将所述扩增产物与链霉亲和素一起孵育。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA或多核苷酸在逆转录期间以小于或等于约1μM的浓度存在。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA或多核苷酸在逆转录期间以约1
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10nM、约10
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20nM、约20
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30nM、约30
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40nM、约40
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50nM、约50
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75nM、约75
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100nM、约100
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150nM、约150
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200nM、约200
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300nM、约300
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400nM或约400
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500nM范围内的浓度存在。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶产生全长cDNA，并且其中至少25％的所述全长cDNA包含所述非天然核苷酸。20.根据前一项权利要求所述的方法，其中至少50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的所述未截短的cDNA包含所述非天然核苷酸。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述非天然核糖核苷酸的RNA或多核苷酸是mRNA。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述非天然核糖核苷酸(X或Y)位于所述mRNA的密码子的第一位置(X
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N
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N或Y
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N
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N)。23.根据权利要求20所述的方法，其中所述非天然核糖核苷酸(X或Y)位于所述mRNA的密码子的中间位置(N
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X
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N或N
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Y
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N)。24.根据权利要求20所述的方法，其中所述非天然核糖核苷酸(X或Y)位于所述mRNA的密码子的最后位置(N
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N
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X或N
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N
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Y)。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中所述mRNA中含有所述非天然核糖核苷酸的密码子是AXC、AYC、GXC、GYC、GXT、GYT、AXA、AXT、TXA或TXT。26.根据权利要求1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：新索思股份有限公司，
类型：发明
国别省市：