本发明专利技术公开了一种耐受表面活性剂的脂肪酶变体及其应用。本发明专利技术提供了一种脂肪酶变体，为将野生型脂肪酶进行点突变后所得，突变位点含有如下中的部分或全部：自N端起第84位、第86位和第92位；所述野生型脂肪酶为来源于疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶。本发明专利技术通过对脂肪酶盖子区域进行点饱和突变获得该酶的突变体，大大提高了脂肪酶对表面活性剂的耐受性。大提高了脂肪酶对表面活性剂的耐受性。
【技术实现步骤摘要】
一种耐受表面活性剂的脂肪酶变体及其应用
[0001]本专利技术涉及生物化工
，具体涉及一种耐受表面活性剂的脂肪酶变体及其应用。
技术介绍
[0002]随着人们对环保意识的加深，对于造纸等用量大且耗费资源多的工业压力越来越大，废纸作为可回收资源，回收效果是最重要的。废纸回收的一大难题就是脱墨，传统脱墨多采用蒸球法和碎浆机疏散法，虽然效果很好，但是纸浆白度低，机器成本高，耗费也很大。酶法脱墨作为一种新生脱墨方法，具有回收率高，成本低，时间短等特点。但纸浆回收时需要加入表面活性剂用于油墨与纤维的脱离，而表面活性剂会严重影响脂肪酶活性，因此，获得耐表面活性剂的脂肪酶十分迫切。
[0003]随着脂肪酶晶体结构的解析，处于活性位点外部的盖子(Lid)结构逐渐被人们所了解。脂肪酶的盖子是一种可以活动的结构，与脂肪酶的主体连接，由一个或多个α
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螺旋组成。脂肪酶位于油水界面时，盖子打开，暴露出活性位点，使得底物能够被水解，这个过程被称为脂肪酶的界面激活(Interfacial activation)。因此，脂肪酶只能作用于油水界面，在油水界面无法形成时，脂肪酶的盖子无法打开，底物也就不能被水解。
[0004]来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶是一个重要的脂肪酶，但对其表面活性剂耐受性定向分子改造研究还很少，限制了其在纸张脱墨、皮革处理中的应用。
技术实现思路
[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种耐受高表面活性剂脂肪酶变体及其编码基因和相关应用。
[0006]第一方面，本专利技术要求保护一种脂肪酶变体。
[0007]本专利技术要求保护的脂肪酶变体为将野生型脂肪酶进行点突变后所得，突变位点含有(或为)如下中的部分或全部：自N端起第84位、第86位和第92位。
[0008]上述三个位点均位于脂肪酶盖子区域。
[0009]优选的，所述脂肪酶变体的氨基酸序列与仅含有上述各突变位点的序列相比具有95％以上的同一性。
[0010]所述95％以上进一步优选为96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。
[0011]其中，所述野生型脂肪酶可为来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶。
[0012]进一步地，所述来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0013]进一步地，所述脂肪酶变体可为如下任一：
[0014](A1)所述脂肪酶变体为将所述野生型脂肪酶的至少如下位点或如下位点的氨基
酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第84位；
[0015](A2)所述脂肪酶变体为将所述野生型脂肪酶的至少如下位点或如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第86位；
[0016](A3)所述脂肪酶变体为将所述野生型脂肪酶的至少如下位点或如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第92位。
[0017]更进一步地，在所述脂肪酶变体中，自N端起第84位的点突变为R84H、第86位的点突变为I86L、第92位的点突变为N92A或N92V。
[0018]在本专利技术中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸(野生型)，位置(即在SEQ ID No.1中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ ID No.1的不同位点突变的突变体依次命名。
[0019]在本专利技术的具体实施方式中，所述脂肪酶变体为如下任一：
[0020](a1)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：R84H(对应变体V1，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)；
[0021](a2)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：I86L(对应变体V2，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)；
[0022](a3)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：N92A(对应变体V3，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)；
[0023](a4)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：N92V(对应变体V4，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示)。
[0024]第二方面，本专利技术要求保护脂肪酶变体相关的生物材料。
[0025]本专利技术要求保护的脂肪酶变体相关的生物材料，可为如下任一：
[0026](I)编码前文第一方面中所述脂肪酶变体的核酸分子；
[0027](II)含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
[0028]进一步地，编码SEQ ID No.1所示野生型脂肪酶的核酸分子为SEQ ID No.2所示DNA分子。
[0029]在本专利技术的具体实施方式中，编码所述脂肪酶变体的核酸分子为如下任一：
[0030](B1)将SEQ ID No.2的第250
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252位的cgt替换为cat后得到的DNA分子(对应R84H，即变体V1的编码基因)；
[0031](B2)将SEQ ID No.2的第256
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258位的ata替换为ctg后得到的DNA分子(对应I86L，即变体V2的编码基因)；
[0032](B3)将SEQ ID No.2的第274
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276位的aat替换为gcg后得到的DNA分子(对应N92A，即变体V3的编码基因)；
[0033](B4)将SEQ ID No.2的第274
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276位的aat替换为gtt后得到的DNA分子(对应N92V，即变体V4的编码基因)。
[0034]在本专利技术的具体实施方式中，所述重组菌为含有所述核酸分子的大肠杆菌。如含有所述核酸分子的大肠杆菌BL21 Gold(DE3)。
[0035]第三方面，本专利技术要求保护前文第一方面中所述脂肪酶变体或前文第二方面中所述的生物材料在如下任一中的用途：
[0036](C1)前文第二方面中所述的生物材料用于制备对表面活性剂耐受性提高的脂肪
酶(即前文第一方面中所述脂肪酶变体)。
[0037](C2)在存在表面活性剂的情况下，前文第一方面中所述脂肪酶变体用于水解脂肪酶底物；如对废旧纸张进行脱墨处理。
[0038](C3)前文第一方面中所述脂肪酶变体或前文第二方面中所述的生物材料用于制备含有所述脂肪酶变体和表面活性剂的混合物，如加酶洗涤剂。
[0039]进一步地，所述表面活性剂可为非离子型表面活性剂或阴离子表面活性剂。
[0040]更进一步地，所述非离子型表面活性剂可为AEO
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9、O本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.脂肪酶变体，为将野生型脂肪酶进行点突变后所得，突变位点含有如下中的部分或全部：自N端起第84位、第86位和第92位；所述野生型脂肪酶为来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶。2.根据权利要求1所述的脂肪酶变体，其特征在于：所述脂肪酶变体为如下任一：(A1)所述脂肪酶变体为将所述野生型脂肪酶的至少如下位点或如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第84位；(A2)所述脂肪酶变体为将所述野生型脂肪酶的至少如下位点或如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第86位；(A3)所述脂肪酶变体为将所述野生型脂肪酶的至少如下位点或如下位点的氨基酸残基进行点突变后得到的蛋白：自N端起第92位。3.根据权利要求1或2所述的脂肪酶变体，其特征在于：所述来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。4.根据权利要求1
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3中任一所述的脂肪酶变体，其特征在于：在所述脂肪酶变体中，自N端起第84位的点突变为R84H、第86位的点突变为I86L、第92位的点突变为N92A或N92V。5.根据权利要求1
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4中任一所述的脂肪酶变体，其特征在于：所述脂肪酶变体为如下任一：(a1)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：R84H；(a2)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：I86L；(a3)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：N92A；(a4)所述脂肪酶变体为将SEQ ID No.1所示的野生型脂肪酶的氨基酸残基进行如下位点的点突变后得到的蛋白：N92V。6.脂肪酶变体相关的生物材料，为如下任一：(I)编码权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：朱蕾蕾，唐梓静，王媛媛，谭子瑊，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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