一种脂肪酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种脂肪酶突变体及其应用，所述突变体命名为S7E/P34S/P46A

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)，又称甘油酯水解酶或三酰甘油酰基水解酶，在细菌、真菌、植物和哺乳动物中均广泛存在。在水油界面上，脂肪酶可催化三酰基甘油(triacylglyceride)水解，生成游离脂肪酸和甘油；脂肪酶属于绿色催化剂，催化多种反应如酯化、酯交换、酸解等，由于这些催化特性，脂肪酶被广泛应用于香料、油脂、制药、洗涤剂、食品和生物柴油等行业中。脂肪酶是继蛋白酶和羧化酶之后第三大商业化酶。
[0003]米黑根毛霉脂肪酶(RML)是一种1,3
‑
位置专一性的脂肪酶，最早于1973年发现，是第一个获得晶体结构的脂肪酶，它可以作用于三酰甘油的1位和3位酯键，在工业上也有十分广泛的应用，且其安全性也被充分验证，在药物动力学拆分、食品添加剂及生物能源行业中广泛应用。在医药行业，RML可用于手性药物的不同对应异构体之间的拆分，如Mohammadi等人用固定化的RML外消旋布洛芬动力学拆分，ee值达92.2％(Mohammadi et al.,2018)。在食品行业，Lorenzoni等人以RML为催化剂，丁醇和丁酸为底物，合成食用香精丁酸丁酯，转化率可达90％(Lorenzoni et al.,2012)。在生物能源行业，Huang等人直接游离RML催化小球藻油制备生物柴油，转化率达到90％以上(Huang et al.,2015)。
[0004]RML的特异性和应用已得证实，但国内RML产量低，导致该酶成本过高，从而使与RML相关的行业成本居高不下，限制了其工业化应用。因此通过基因工程手段提高酶的比活，筛选高效分泌表达体系，提高酶活产量，是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种脂肪酶突变体及其应用，与野生型RML相比，该突变体的最适反应温度、温度耐受性、酶比活和胞外酶活产量均得到提高。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种脂肪酶突变体，所述突变体命名为S7E/P34S/P46A
‑
pRML，是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第7位氨基酸从丝氨酸突变成谷氨酸、第34位氨基酸从脯氨酸突变为丝氨酸、第46位氨基酸从脯氨酸突变为丙氨酸，突变体S7E/P34S/P46A
‑
pRML的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]编码上述脂肪酶突变体的基因，所述基因命名为s7e/p34s/p46a
‑
prml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009]表达上述脂肪酶突变体的基因工程菌。
[0010]上述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0011]将脂肪酶突变体的编码基因s7e/p34s/p46a
‑
prml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA上，构建得到在巴斯德毕赤酵母中的表达载体pPICMα
‑
s7e/p34s/p46a
‑
prml；再将所述表达载体pPICMα
‑
s7e/p34s/p46a
‑
prml导入到巴斯德毕赤酵母X
‑
33中，即得；
[0012]所述表达载体pPICMαA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0013]优选地，所述脂肪酶突变体的编码基因s7e/p34s/p46a
‑
prml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA上的目的基因拷贝数为1
‑
5。
[0014]一种脂肪酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0015]步骤1)培养上述的基因工程菌，培养条件为：温度28℃，初始pH为7，180rpm摇床培养16～18h；
[0016]步骤2)经诱导表达获得脂肪酶突变体S7E/P34S/P46A
‑
pRML，诱导条件为：每24h补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％，摇瓶培养。
[0017]优选地，步骤2)所述摇瓶培养的时间为120～170h；所述脂肪酶突变体S7E/P34S/P46A
‑
pRML的最适反应温度为50℃，最适反应pH为7～8。
[0018]本专利技术的有益效果如下：
[0019]本专利技术的脂肪酶突变体，具有较高的酶活性。本专利技术通过构建恰当的表达载体，使脂肪酶突变体基因在巴斯德毕赤酵母X
‑
33中分泌表达，表达的脂肪酶大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，而且表达效率较高，在摇瓶培养的条件下，以甲醇诱导培养时，分泌到胞外的酶量可达276mg/L，以橄榄油为底物，酶活可达1740U/mL，胞外酶活提高1.8倍，酶活分泌效率提高1.9倍，酶比活提高2.26倍。本专利技术为米黑根毛霉脂肪酶的工业化应用奠定了基础。
附图说明
[0020]图1为实施例2中突变体基因s7e/p34s/p46a
‑
prml和野生型pro
‑
rml核苷酸序列比对；
[0021]图2为实施例2中突变体S7E/P34S/P46A
‑
pRML和野生型PRO
‑
RML氨基酸序列比对；
[0022]图3为实施例2中pPICMα
‑
s7e/p34s/p46a
‑
prml的质粒图谱；
[0023]图4为实施例3中pPICMα
‑
s7e/p34s/p46a
‑
prml电转化到巴斯德毕赤酵母X
‑
33，在YPDS培养基上经Zeocin抗性筛选的图；
[0024]图5为实施例3中PCR筛选鉴定阳性转化子的琼脂糖凝胶电泳图；
[0025]图6为实施例3中摇瓶培养的野生型和突变体菌株的细胞密度、胞外酶活、酶活分泌效率及比活检测图：A为细胞生长曲线，B为胞外酶活曲线，C为酶活分泌效率，D为比活。
具体实施方式
[0026]下面结合附图与具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。
[0027]以下实施例所用实验试剂如无特别说明，均通过商业途径购买。
[0028]巴斯德毕赤酵母X
‑
33购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher)，货号为C18000。
[0029]pPICZαA购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher)，货号为V19520。
[0030]实施例1
[0031]一种脂肪酶突变体，为便于表述，将该突变体命名为S7E/P34S/P46A
‑
pRML。突变体S7E/P34S/P46A
‑
pRML是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第7位氨基酸从丝氨酸(Ser，S)突变成谷氨酸(Glu，E)，密码子从TCA突变为GAA；第34位氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体命名为S7E/P34S/P46A
‑
pRML，是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第7位氨基酸从丝氨酸突变成谷氨酸、第34位氨基酸从脯氨酸突变为丝氨酸、第46位氨基酸从脯氨酸突变为丙氨酸，突变体S7E/P34S/P46A
‑
pRML的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因，其特征在于，所述基因命名为s7e/p34s/p46a
‑
prml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.表达权利要求1所述脂肪酶突变体的基因工程菌。4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将脂肪酶突变体的编码基因s7e/p34s/p46a
‑
prml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA上，构建得到在巴斯德毕赤酵母中的表达载体pPICMα
‑
s7e/p34s/p46a
‑
prml；再将所述表达载体pPICMα
‑
s7e/p34s/p46a

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金金，钱懿帆，杨千千，袁博，杨嘉佳，周逸茗，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：