一种共价交联法固定化米根霉脂肪酶的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种共价交联法固定化米根霉脂肪酶的制备方法和应用，属于固定化脂肪酶制备技术领域。本发明专利技术通过制备直径约为350

【技术实现步骤摘要】
一种共价交联法固定化米根霉脂肪酶的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于固定化脂肪酶制备
，涉及亲水性载体Uio
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NH2材料固定米根霉脂肪酶的方法，具体涉及一种共价交联法固定化米根霉脂肪酶的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]米根霉来源脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase，ROL)具有良好的SN
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1，3位置催化特异性和类型选择性，催化油水解脂肪酸的选择性酯化，能够改变甘油骨架链接的脂肪酸类型，生产出具有某些特殊功能的构造油脂，是生产生物柴油良好的催化剂，在食品、化工、医药及生物能源等方面都有广泛的应用。尽管如此，游离ROL在工业上的应用仍然有限，因为在利用脂肪酶生产生物柴油过程中，通常使用高度非极性的反应介质，这可能导致酶解吸，从而导致游离酶操作稳定性差并且难以回收利用。因此寻找合适的固定化脂肪酶ROL的载体和方法，提高其适用性具有十分重要的意义。
[0003]金属有机骨架(Metal
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organic Frameworks，MOFs)是一类由金属离子或金属团簇和有机配体(连接剂)通过配位键(或是共价键)连接而形成具有网状晶体结构的多孔材料，目前，MOFs主要应用于气体吸附与储存、化学传感、催化以及药物递送等多种领域。而且因其独特的多样拓扑结构、高孔隙率和优异的比表面包括其他良好的物理特性使它们在生物酶固定化中作为载体材料存在多种潜在价值。在最近报道的一些研究中，发现将酶固定在MOFs上后，固定化酶不仅在可重复使用性和稳定性方面的性能方面得到提升，并且部分基于MOFs结构制备的固定化脂肪酶展现了催化活性的提升的特性。其中Zr基MOF(Uio
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66s)作为MOFs材料的一种，具有高热稳定性、水稳定性和对pH条件的优异耐受性等特性，这使其适合用于水性反应介质。并且Uio
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66s具有优异的亲水性也有助于保持酶活性。
[0004]目前，通常采用表面吸附法和共价交联法两种手段制备基于Uio
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NH2材料的固定化脂肪酶。其中，表面吸附法通过将脂肪酶分子与已合成的Uio
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NH2载体共同孵育，通过物理吸附(氢键、静电相互作用、范德华力等)和共价键结合将脂肪酶固定在载体表面制备固定化脂肪酶；共价交联法则是将酶分子首先通过共价键与Uio
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NH2载体进行结合，然后采用多功能试剂和酶分子之间的共价键，得到三向交联网状结构，从而达到固定化的效果。研究表明，相较于利用表面吸附法制备的固定化脂肪酶具有易导致酶失活，操作复杂、耗时以及成本高等缺点，通过共价交联法制备的基于Uio
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NH2结构的固定化脂肪酶能够克服上述缺点，能在较温和的条件下将酶固定在载体上，并且展现了更好的稳定性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种共价交联法固定化米根霉脂肪酶的制备方法和应用，能有效解决现有技术制备的固定化酶催化活性不高，稳定性受影响的问题。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术公开了一种固定化米根霉脂肪酶的可控化制备方法，包括：首先将氯化锆和2
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氨基对苯二甲酸混合于N，N
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二甲基甲酰胺液中，预热80℃搅拌反应2h后，加热120℃搅
拌反应24h后，冷却离心、洗涤、收集沉淀物，在通风橱内过夜干燥得到Uio
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NH2，将制备得到的载体加入含有米根霉脂肪酶的溶液混合均匀后，加入饱和硫酸铵溶液，搅拌30min沉淀酶后，加入戊二醛溶液交联，洗涤、收集沉淀物，真空冷冻干燥处理，制得固定化脂肪酶ROL@Uio
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NH2。
[0008]优选地，氯化锆溶液浓度为64mmol/L，2
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氨基对苯二甲酸溶液浓度为64mmol/L，氯化锆溶液与2
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氨基对苯二甲酸溶液的体积比为1∶1。在油浴锅中搅拌反应条件为300
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500rpm的转速下80℃预热2h，然后升温至120℃加热24h，采用N，N
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二甲基甲酰胺洗涤沉淀物3
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5次，收集的沉淀物在通风橱内干燥48h得到Uio
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NH2。
[0009]本专利技术还公开了采用上述方法制备得到的亲水性Uio
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NH2载体材料。
[0010]优选地，Uio
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NH2的质量为50mg，戊二醛溶液的浓度为25％，含有米根霉脂肪酶的溶液浓度为5mg/mL。筛选出最优制备条件：Uio
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NH2和含有米根霉脂肪酶的溶液质量比为25∶3。饱和硫酸铵溶液、戊二醛溶液和含有米根霉脂肪酶的溶液体积比为2∶1∶1。搅拌反应在300
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500rpm的转速下进行。采用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀物3
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5次，收集的沉淀物在
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80℃条件下真空冷冻干燥处理12h。
[0011]本专利技术还公开了采用上述方法制备得到的亲水性Uio
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NH2载体材料利用共价交联法制得的固定化米根霉脂肪酶。
[0012]优选地，该固定化米根霉脂肪酶在40
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70℃、pH值为7.0
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10.0条件下的稳定性均高于游离酶。
[0013]本专利技术还公开了上述的固定化米根霉脂肪酶在制备工业生物催化剂中的应用。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：
[0015]本专利技术公开的固定化米根霉脂肪酶的制备方法，将制备得到的亲水性载体Uio
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NH2与含有米根霉脂肪酶的溶液进行搅拌反应，加入饱和硫酸铵溶液，待酶沉淀后，加入戊二醛溶液，采用共价交联法固定米根霉脂肪酶(ROL)，制备得到固定化脂肪酶ROL@Uio
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NH2。
[0016]进一步地，以戊二醛作为交联剂，ROL通过共价交联的方式固定在Uio
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NH2上，由于固定化条件对酶的催化活性和蛋白质装载能力有明显影响，因此，通过调节亲水性载体Uio
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NH2和米根霉脂肪酶的质量比，以及优选交联剂浓度、交联时间以及沉淀时间等参数，得到最佳的酶固定化效率。本专利技术优选Uio
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NH2和含有米根霉脂肪酶的溶液的质量比为25∶3，戊二醛浓度为20％，饱和硫酸铵溶液、戊二醛溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化米根霉脂肪酶的制备方法，其特征在于，将氯化锆和2
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氨基对苯二甲酸混合于N，N
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二甲基甲酰胺中，预热搅拌反应2h后，加热搅拌反应24h后，冷却离心、洗涤、收集沉淀物，在通风橱内过夜干燥获得载体Uio
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NH2，将其加入含有米根霉源脂肪酶的溶液中，混合均匀后，加入饱和硫酸铵溶液，搅拌30min，待酶沉淀后，加入戊二醛溶液进行交联，洗涤后，将收集的沉淀物真空冷冻干燥处理，制得固定化脂肪酶ROL@Uio
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NH2。2.根据权利要求1所述的Uio
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NH2金属有机框架材料的制备方法，其特征在于，氯化锆溶液的浓度为64mmol/L，2
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氨基对苯二甲酸溶液的浓度为64mmol/L，氯化锆溶液与2
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氨基对苯二甲酸溶液的体积比为1∶1。3.根据权利要求1所述的Uio
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NH2金属有机框架材料的制备方法，其特征在于，在油浴锅中搅拌反应条件为300
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500rpm转速下80℃预热2h，然后升温至120℃加热24h，采用N，N
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二甲基甲酰胺洗涤沉淀物3
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5次，收集的沉淀物在通风橱内干燥48h得到Uio
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【专利技术属性】
技术研发人员：李秀婷，张成楠，杜秉昊，芦瑜涵，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：