基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法，属于生物与医学检测技术领域，本发明专利技术采用的是重组酶聚合酶扩增（RPA）基因编辑CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法


[0001]本专利技术属于生物与医学检测
，具体涉及一种基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病（Alzheimer
’
s disease，AD）是一种中枢神经系统变性病。AD 作为严重危害人类晚年健康和社会经济发展的全球公共卫生重大问题，亟需对其发病机制和防治开展深入研究。
[0003]以发病年龄（age at onset，AAO）65 岁为界，AD 可分为早发性 AD（early
‑
o nset AD，EOAD）（AAO≤65 岁）和晚发性 AD（late
‑
onset AD，AAO>65 岁）。载脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因的多态性是决定AD的主要遗传风险因素。APOE可通过参与β
‑
淀粉样蛋白（β
‑
amyloid，Aβ）生成、tau蛋白与微管蛋白连接、突触可塑性及脂质代谢等途径，影响AD的发生。APOE的三个异构体即：APOE ε2，APOE ε3， APOE ε4。APOE基因上rs429358位点和rs7412位点对应的碱基分别为T和C；rs7412位点C突变为T即为ε2，rs429358位点T突变为C即为ε4。APOE ε3等位基因参与人体正常功能的维持；APOE ε2等位基因为保护因素，可降低心脑血管疾病的发生；APOE ε4等位基因的存在会大大提高AD的患病风险。
[0004]早期识别携带APOE ε4基因突变的患者对于研究疾病发病机制、家系遗传学咨询和早期干预尤为重要。2011年美国医学遗传学学会（the American College of Medical Genetics，ACMG）和美国国家遗传咨询师协会（the National Society of Genetic Counselors, NSGC）有关AD遗传学咨询检测的实践指南推荐仅对至少具有2名患病一级亲属的 EOAD 患者进行遗传学检测。越来越多的研究也致力于APOE ε4等位基因与各种潜在标志物之间关系及机制的探索，从而提高AD的早期筛查，建立更为完善的AD风险预警系统。
[0005]目前携带基因检测有多种方法，如：PCR
‑
RFLP、TaqMan 荧光探针法、QPCR
‑ꢀ
HRM等。PCR
‑
RFLP 法过程较繁琐、耗时长；TaqMan 荧光探针法价格较为昂贵；QPCR
‑
HRM相对简单但该方法存在假阳性高，分辨率低的问题。以上方法都需要特定昂贵的设备、专业的操作人员、整个扩增过程需要几个小时才可以完成相应的检测，因上述原因现有技术难以满足大范围的基层筛查需求。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法，该方法不仅能将样品处理时间大幅度缩短，试剂和仪器成本大幅度降低，还能提高检测的精准度和实现移动检测以及家庭自助式检测等功能，能够带来可预见的巨大经济效果。
[0007]为实现以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法，包括以下步骤：
步骤1，设计RPA扩增引物及crRNA 序列：由SNP位点rs429358和rs7412位点确定出APOE的核心鉴定区域，再设计出对应的RPA引物及两条crRNA 序列，分别为crRNA 序列1和crRNA 序列2；步骤2，提取待测样本的基因组DNA：以人体口腔上颚组织细胞为待测样本，加入DNA提取液中，用尼龙纤维制小刷子刮取上颚组织，随后将刷子在提取液中搅拌充分混匀，随后静置于桌面2
‑
5min，使其充分反应；步骤3，等温扩增反应：以上述步骤2得到的DNA为模板，以步骤1设计的RPA为引物进行等温扩增反应，将DNA滴入一滴于反应体系中，在37 ℃反应40min，得到RPA扩增产物；步骤4，根据步骤1设计的两条crRNA 引导序列分别制备Cas12a/crRNA复合物1和Cas12a/crRNA复合物2，再加入ssDNA荧光探针及步骤3得到的RPA扩增产物，在CRISPR/Cas12a体系中进行裂解反应，分别得到裂解产物1和裂解产物2；步骤5，将步骤4得到的裂解产物1和裂解产物2分别使用胶体金试纸条1和试纸条2同时进行显色检测；若在两个胶体金试纸条上的检测线出现红色条带或检测线和阴性样本质控线位置均出现红色条带，则表示待测样本含APOEε4基因；若胶体金试纸条1检测线不出现红色条带，而试纸条2出现红色条带，则表示待测样本中APOE基因型为APOE ε3基因；若胶体金试纸条1和试纸条2的检测线均不出现红色条带，则表示待测样本中APOE基因型为APOE ε2基因。
[0008]进一步地，所述步骤1中RPA扩增引物序列为：RPA
‑
APOE
‑
F：5
’‑
AACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCG
‑3’
；RPA
‑
APOE
‑
R：5
’‑
ACCTCCGCCACCTGCTCCTTCACCTCGTCCA
‑3’
。
[0009]进一步地，所述步骤1中crRNA 序列为：crRNA 序列1（rs429358）：5
‑
mC*U*GCCCGGCUGGGCGCGGACAUGGAGGACGUGC*G*mU
‑3’
，crRNA 序列2（rs7412）：5
‑
mC*U*UAAGCGGCUCCTCCGCGAUGCCGAUGACCUGCAGAAGC*mU
‑3’
；*为硫代修饰，m为甲氧基修饰。
[0010]进一步地，所述步骤2中提取液包括0.5
‑
1.0 mol/L的氢氧化钠、10
‑
20 mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、2
‑
5mol/L的醋酸钾、水。
[0011]进一步地，所述步骤3中反应体系为：10
‑
20 μM RPA
‑
APOE
‑
F 2.4 μL，10
‑
20 μM RPA
‑
APOE
‑
R 2.4 μL，Rehydration buffer 29.5 μL，250
‑
300 mM MgOAc 2.5 μL，RNase
‑
free H2O加至50 μL。
[0012]进一步地，所述步骤4中ssDNA荧光探针序列为：5
’‑
FITC
‑
TTTTTT
‑
Biotin
‑3’
。
[0013]进一步地本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，设计RPA扩增引物及crRNA 序列：由SNP位点rs429358和rs7412位点确定出APOE的核心鉴定区域，再设计出对应的RPA引物及两条crRNA 序列，分别为crRNA 序列1和crRNA 序列2；步骤2，提取待测样本的基因组DNA：以人体口腔上颚组织细胞为待测样本，加入DNA提取液中，用尼龙纤维制小刷子刮取上颚组织，随后将刷子在提取液中搅拌充分混匀，随后静置于桌面2
‑
5min，使其充分反应；步骤3，等温扩增反应：以上述步骤2得到的DNA为模板，以步骤1设计的RPA为引物进行等温扩增反应，将DNA滴入一滴于反应体系中，在37 ℃反应40min，得到RPA扩增产物；步骤4，根据步骤1设计的两条crRNA 引导序列分别制备Cas12a/crRNA复合物1和Cas12a/crRNA复合物2，再加入ssDNA荧光探针及步骤3得到的RPA扩增产物，在CRISPR/Cas12a体系中进行裂解反应，分别得到裂解产物1和裂解产物2；步骤5，将步骤4得到的裂解产物1和裂解产物2分别使用胶体金试纸条1和试纸条2同时进行显色检测；若在两个胶体金试纸条上的检测线出现红色条带或检测线和阴性样本质控线位置均出现红色条带，则表示待测样本含APOEε4基因；若胶体金试纸条1检测线不出现红色条带，而试纸条2出现红色条带，则表示待测样本中APOE基因型为APOE ε3基因；若胶体金试纸条1和试纸条2的检测线均不出现红色条带，则表示待测样本中APOE基因型为APOE ε2基因。2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法，其特征在于，所述步骤1中RPA扩增引物序列为：RPA
‑
APOE
‑
F：5
’‑
AACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCG
‑3’
；RPA
‑
APOE
‑
R：5
’‑
ACCTCCGCCACCTGCTCCTTCACCTCGTCCA
‑3’
。3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR基因编辑技术的AD携带基因检测方法，其特征在于，所述步骤1中crRNA 序列为：crRNA 序列1（rs429358）：5
‑
mC*U*GCCCGGCUGGGCGCGGACAUGGAGGACGUGC*G*mU
‑3’
，crRNA 序列2（rs7412）：5
‑
mC*U*UAAGCGGCUCCTCCGCGAUGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈远超，胡安琪，杨广程，洪航，廖嘉成，覃可盈，
申请(专利权)人：湖南永和阳光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：