本发明专利技术公开了，属于抑郁症诊断技术领域。本发明专利技术公开外周血血浆神经元细胞来源外泌体内hsa_circFKBP8_011作为诊断抑郁症新用途。首先从抑郁症、躁狂症、精神分裂症患者及健康受试者外周血血浆提取总外泌体，随后利用免疫沉淀法分离提取外周血血浆神经元细胞来源外泌体(NDE)，对神经元来源外泌体进行电镜、免疫蛋白印记表征；使用绝对定量PCR检测hsa_circFKBP8_011。发现抑郁症、精神分裂症患者及健康受试者外周血血浆神经元细胞来源外泌体中hsa_circFKBP8_011中存在显著差异表达，表明外周血血浆神经元来源外泌体中hsa_circFKBP8_011在抑郁症患者中表达水平增高。因此，外周血血浆中神经元细胞来源外泌体中hsa_circFKBP8_011水平检测在抑郁症的诊断中具有很高的临床应用价值。具有很高的临床应用价值。具有很高的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
血浆神经元细胞来源外泌体内hsa_circFKBP8_011在抑郁症诊断中的应用
[0001]本专利技术涉及抑郁症诊断
，具体涉及血浆神经元细胞来源外泌体内hsa_circFKBP8_011在抑郁症诊断中的应用。
技术介绍
[0002]抑郁障碍是最常见的精神疾病，根据2019年WHO统计数据，全球患病率为4.4％，目前约有3亿人患有抑郁障碍，患者的高自杀、自残率给社会带来了沉重负担，预计2030年抑郁障碍将跃居全球疾病负担排行榜首位。目前，世界范围内MDD的诊断标准使用最为广泛的是《精神疾病诊断和统计手册》(DSM5)和《国际疾病分类》(ICD11)标准，这些诊断标准都依赖于临床医生对症状学的主观判断，始终缺乏疾病诊断客观标记。
[0003]外泌体是小细胞外囊泡(sEVs)，起源于内体系统中的腔内囊泡，并在多泡体与质膜融合后分泌到血液、尿液、唾液和母乳在内的各种体液中。外泌体携带来自其亲代细胞的大量细胞成分，包括蛋白质、脂质、DNA、mRNA和非编码RNA(ncRNA))。这些外泌体货物可以从它们的亲代细胞输送到受体细胞。环状RNA因其共价闭合环结构可以保护它免受外切酶介导的降解而高度稳定，因此广泛应用于诊断标志物相关研究。
[0004]目前抑郁症的主要诊断标准依然是症状诊断，但由于抑郁症患者个体差异大、病因复杂、症状多种多样以及高危个体识别率低等原因，单纯依赖于症状的诊断已经不能满足临床对于抑郁症诊断和分级的要求。因此，急需要一种客观、可靠的诊断标志物。
技术实现思路
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提出了血浆神经元细胞来源外泌体内hsa_circFKBP8_011(circBase ID：hsa_circ_0050119)在抑郁症诊断中的应用。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术的第一方面，涉及一种用于诊断抑郁症的试剂盒，包括用于检测神经元细胞来源外泌体中hsa_circFKBP8_011的试剂。
[0008]可选地，所述试剂为qPCR试剂。
[0009]可选地，所述试剂盒为HiScript Q RT SuperMix for qPCR Kit反转录试剂盒。
[0010]本专利技术的第二方面，涉及检测神经元细胞来源外泌体中hsa_circFKBP8_011的试剂在制备用于诊断抑郁症的试剂盒中的应用。
[0011]其中，所述hsa_circFKBP8_011的表达量与诊断患有抑郁症的结果呈正相关。
[0012]本专利技术的第三方面，涉及一种用于诊断抑郁症的系统，包括：
[0013]用于分离与提取血浆总外泌体以及神经元来源外泌体总RNA的提取模块；
[0014]用于表征与标记神经元来源外泌体的表征模块；以及
[0015]用于检测神经元细胞来源外泌体中hsa_circFKBP8_011的检测模块。
[0016]可选地，所述的表征模块包括透射电子显微镜以及蛋白质印迹检测试剂盒。
Rating Scale,YMRS)。
[0031]1、血浆神经元细胞来源外泌体提取
[0032](1)血浆总外泌体的分离提取：
[0033]将200μL血浆转移至1.5mL微量离心管并以300x g离心10min以去除细胞。将离心后的上清液置入新的离心管并以16,000x g离心30min。将上清液转移到新的1.5mL离心管中，加入100ul Exo
‑
spinTM沉淀剂；颠倒离心管混匀，并在4℃孵育1h。将混合液以16,000x g离心1h。小心吸出并弃去上清液。用100μL PBS重悬含有外泌体的沉淀。在室温下回温15min以平衡Exo
‑
spinTM纯化管柱。使用移液枪从纯化管柱顶部吸弃防腐保存液；加入250μL PBS缓冲液，让液体在重力作用下进入柱基质中，丢弃流出的缓冲液，重复2次。
[0034]将100μL外泌体重悬液加入纯化管柱顶端，然后将管柱放入废液收集管中，通过重力作用下进入柱基质中，丢弃流出液。将纯化管柱置入新的1.5mL离心管以收获外泌体；将180μL的PBS加入纯化管柱顶端，并通过重力洗脱。将含有分离外泌体的样本收集管以100x g短暂离心30s，获得200ul总外泌体重悬液。
[0035](2)使用神经元细胞标记物进行外泌体的免疫沉淀(IP)
[0036]60μl链霉亲和素磁珠(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)用1ml洗涤缓冲液(含0.1％ Tween
TM
‑
20洗涤剂的tri
‑
buffered saline(TBS))洗涤两次。用磁力架收集磁珠(e.g.,Thermo Scientific
TM
DynaMag
TM
‑
2Magnet,Product No.12321D)，然后去除上清液，重新悬浮在250ml隔离缓冲液中(PBS中0.1％BSA)。为了进行抗体标记，将5μg生物素标记的抗体L1CAM/CD171
‑
Biotin(Cat.No.13
‑
1919
‑
82,ThermoFisher Scientific)与磁珠孵育，室温下连续混合1小时。将总外泌体(200μl)与抗体标记磁珠在4℃连续混合孵育过夜(24h)。然后磁化磁珠，去除上清液。用1ml洗涤缓冲液洗涤四次，最后用含1％BSA和PPi的200μl PBS重悬。最后，在新的EP管中加入200μl珠粒(带有神经元细胞来源外泌体)，并在管中加入100μl洗脱缓冲液(0.1M glycine,pH 3.0)。将EP管在室温下混合5分钟。磁力架去除磁珠，得到的溶液就是我们想要收集的特定脑细胞亚群外泌体。然后将得到的溶液的pH调整为7.0(1M Tris
‑
HCl(pH＝8.6))。通过透射电子显微镜、蛋白质印迹(Western blot)、对含有目标外泌体的所得溶液进行表征。
[0037]其中，外泌体电镜结果(来自健康对照组组神经来源外泌体)，如图1所示。血浆内外泌体表征实验结果如图2所示。
[0038]2、透射电镜：将制备与队列样品相同的30μL超速离心参比血浆沉积在涂有穿孔碳膜的电子显微镜网格上并孵育30分钟；液体从网格的背面吸干，并使用徕卡EMCPC冷冻室将网格快速投入液体乙烷中。在EM观察之前，EM网格存储在液氮下。使用用Titan Krios电子显微镜(赛默飞世尔科技)进行的。
[0039]3、Western blot：将3组神经来源外泌体200ul和提取神经元来源外泌体后的其他外泌体50ul分别加入RIPA缓冲液与蛋白酶抑制剂。外泌体在10％sds
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聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到PVDF膜上。使用的抗体为抗cd63(Abcam，ab68418)、抗tsg101(SantaCrus，sc
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于诊断抑郁症的试剂盒，其特征在于，包括用于检测神经元细胞来源外泌体中hsa_circFKBP8_011的试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为qPCR试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为HiScript QRT SuperMix for qPCR Kit反转录试剂盒。4.检测神经元细胞来源外泌体中hsa_circFKBP8_011的试剂在制备用于诊断抑郁症的试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为qPCR试剂。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述所述hsa_circFKBP8_011的表...
【专利技术属性】
技术研发人员：张志珺，曹育嘉，焦娇，张高嘉，徐丹丹，孔岩，师亚晨，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：
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