一种用于维生素C缺乏风险评估的检测试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种维生素C缺乏风险评估的检测试剂盒及其应用方法，涉及生物医学技术领域，针对目标位点SLC23A1基因rs10063949、rs6596473及SLC23A2基因rs1279683、rs12479919、rs6133175设计特异性引物,利用MALDI

【技术实现步骤摘要】
一种用于维生素C缺乏风险评估的检测试剂盒及其应用方法


[0001]本专利技术涉及本专利技术涉及生物医学
，特别是涉及一种用于维生素C缺乏风险评估的检测试剂盒及其应用方法。

技术介绍

[0002]维生素C是一种水溶性维生素，其主要作用是维持血管弹性，增强毛细血管抵抗力，降低其脆性与通透性，并促进其细胞增生和防治血细胞凝集。维生素C缺乏会影响胶原蛋白合成，使毛细血管脆性增高，从而导致坏血病，维生素C能治疗坏血病且具有酸性，所以也被称作抗坏血酸。是体内多种酶反应途径的重要辅助因子，在胶原蛋白的合成过程中需要在羟化酶的催化作用下将脯氨酸和赖氨酸羟化，而羟化酶活性中心的铁原子需要维生素C来保持亚铁状态。缺少维生素C会使胶原羟化不完全，结构松散，不能正常形成纤维，容易造成皮肤损伤和血管脆裂，引发坏血病。除胶原外，肉碱、去甲肾上腺素等的合成过程也需要类似的羟化酶，也需要维生素C。
[0003]维生素C容易氧化，是强力抗氧化剂，也可作为氧化还原载体，参与人体多种氧化还原反应，为其提供电子，自身则转化为氧化态，并可以通过谷胱甘肽和NADPH依赖的酶促反应恢复到还原状态。维生素C在免疫系统调节中也发挥着重要作用，其可以促进淋巴细胞增殖，并在感染期间迅速消耗。两次诺贝尔奖得主LinusCarlPauling主张大剂量服用维生素C，认为维生素C可以预防感冒、抗病毒和抗癌，但医学界一直存在争议，目前认为维生素C在一般人群中对感冒没有明显的预防作用，但可能会缩短感冒的时间，或降低严重程度。此外，维生素C可以还原铁，促进其吸收，还可以保护维生素A、E及部分B族维生素免遭氧化等。
[0004]在发达国家，维生素C缺乏症大多由饮食中维生素C含量低而引起，但重度缺乏症导致的坏血病不常见。中国居民营养与健康状况监测(2010
‑
2013)的调查结果显示，中国居民维生素摄入状况不太乐观，维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素E摄入量明显低于中国居民膳食营养素参考摄入量(DRIs)。成人饮食中缺乏维生素C时会觉得易疲劳、乏力和烦躁，可能会有体重减轻、肌肉萎缩和关节疼痛，持续几个月的低维生素C饮食就可能引起坏血病。婴儿维生素C缺乏可能会烦躁，活动时有疼痛感，并失去食欲，体重没有正常地增长。婴幼儿和儿童维生素C缺乏可使骨骼生长受累，并可能出现出血和贫血。此外，长期服用维生素C过多可能导致草酸及尿酸结石，增加肾结石风险，短期内服用维生素C过量，会产生多尿、下痢、皮肤发疹等副作用。
[0005]自然界中的维生素C存在两种形式：还原型抗坏血酸(主要类型)和氧化性脱氢抗坏血酸，这两种形式同不同的运输体系进入体内，其中还原型维生素C摄入主要由钠离子依赖的维生素C转运蛋白(SVCT)家族负责，SVCT1和SVCT2是目前已经被鉴定和研究的两个家族成员。氧化型维生素C则由葡萄糖转运蛋白(GLUT)家族负责运输，目前认为至少3个成员参与该过程，即GLUT1、GLUT3、GLUT4。研究表明，SVCT1由SLC23A1基因编码，在内皮系统表达，介导维生素C的肠吸收和肾脏重吸收，而SVCT2由SLC23A2基因编码，广泛表达于脑、骨骼和其他组织，保护这些组织免遭氧化损伤。SVCT家族是机体维生素C内稳态维持的关键因
素。营养遗传学研究表明，SLC23A1、SLC23A2基因多态性与维生素C的代谢有关，因此，针对维生素C的营养状况调查及缺乏风险评估需要对SLC23A1、SLC23A2基因多态性进行分型。
[0006]目前，常用的基因多态性分型方法包括测序法、PCR
‑
RFLP法、TaqMan探针法、DNA芯片法等，其中，测序法测序是最为准确的方法，也是基因分型的金标准，但价格也非常昂贵，且通量有限，适用于样本量特别小的项目，同时检测多个位点时不适用；PCR
‑
RFLP法操作简单，费用低廉，但需要大量人力，耗时相对较长，不适合高通量大样本检测；TaqMan探针法针对基因多态性位点变异设计特异性的探针，适合于大样本、少位点检测，但探针标记成本较高，价格昂贵；DNA芯片法通量高，在进行多位点同时检测时条件难以控制、可重复性差，易出现假阳性假阴性结果，准确性较低，适合于全基因组关联分析；
[0007]现有技术Nutrigenetic investigations into vitamin C and plant sterols (http://hdl.handle.net/1993/35478)公开了众多与维生素C相关的SNP，但是其中部分SNP并非试用与普通人，例如rs1279386位点的描述引自补充参考文献PMID：22171153，该文献中阐述的是SLC23A2基因多态性与原发性开角型青光眼(POAG)疾病风险之间的关系，其中SLC23A2基因多态性与维生素C血清水平之间的关系也是在原发性开角型青光眼(POAG)患者人群中得出的结论，并不一定适用于普通人群；现有技术PMID:24815519共检测rs6596473、rs1279683、rs12479919及rs4257763四个位点，其中仅rs6596473和rs12479919位点与维生素血清水平之间的关系得出显著性差异的结果，何如精选SNP组合成了现有技术急需解决的问题。
[0008]因此，上述方法在检测通量、成本、适用性方面均存在不同程度的缺陷，不适用于维生素C代谢标志物的基因多态性检测，本专利技术旨在建立一种操作简单、快速有效、价格低廉，且能满足人群筛查通量的基因多态性分型方法，以满足维生素C代谢标志物的快速分型及缺乏风险筛查。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种用于维生素C代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法，提供基于MALDI
‑
TOF System(时间飞行质谱生物芯片系统)采用所述检测试剂盒进行维生素C代谢标志物的基因多态性分型方法。
[0010]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的用于维生素C代谢标志物的基因多态性检测试剂盒的技术方案如下：
[0011]本专利技术的试剂盒针对SLC23A1基因rs10063949、rs6596473及SLC23A2基因rs1279683、rs12479919、rs6133175多态性位点设计特性多重PCR扩增引物，引物长度为18
‑
30bp，引物组序列如SEQ ID NO.1
‑
10所示。
[0012]本专利技术的试剂盒包括上述引物组，以及用于多重PCR的反应液，组成成分如下：
[0013][0014]本专利技术的试剂盒用于维生素C代谢标志物的基因多态性检测方法包括以下步骤：
[0015](1)采集受检者唾液、口腔拭子样本或血液样本，提取基因组DNA；
[0016](2)采用引物组对基因组DNA的片段进行PCR扩增，包括至少一次基因片段扩增，至少一次产物碱性磷酸酶处理和至少一次单碱基延伸引物反应扩增，得到扩增产物混合液；
[0017](3)将扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于评估与维生素C缺乏风险相关SNP位点的引物组合物，其特征在于：所述SNP位点包括：rs10063949、rs6596473、rs1279683、rs12479919和rs6133175。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物包括特异性扩增引物序列和单碱基延伸引物。3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于：所述特异性扩增引物序列包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，所述单碱基延伸引物包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15。4.一种用于维生素C缺乏风险评估的检测产品，其特征在于：所述产品包含权利要求1
‑
权利要求3任一所述的引物组合物。5.根据权利要求4所述的检测产品，其特征在于：所述检测产品包括试剂盒或芯片。6.权利要求1
‑
3任一所述的引物组合物或权利要求4
‑
5任一所述的产品在评估维生素C缺乏风险的SNP位点中的应用。7.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨吉涛，李斌，
申请(专利权)人：北京欧飞基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：