重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白及其制备方法和应用，该蛋白由铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PcrV、OprI和PA热休克蛋白GroEL的有效成分构成，其可应用于制备铜绿假单胞菌纳米颗粒疫苗。本发明专利技术rePO

【技术实现步骤摘要】
重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及制药
，具体涉及重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白rePO
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GroEL及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]2017年WHO发布了一份优先研发新抗生素的病原体清单，铜绿假单胞菌被列为“最危急”等级，它的出现和传播已成为严峻的公共卫生问题，主要有以下三个原因：第一，PA是一种条件致病菌，可对免疫功能受损或天然防御系统被破坏的患者造成严重感染，它是引起医院获得性肺炎的主要原因，有数据表明医院获得性肺炎患者的死亡率为13％到50％左右。第二，PA具有极强的耐药性。目前临床上主要使用抗生素进行治疗，但效果不佳，患者死亡率仍高达40.2％。第三，随着抗生素的使用，逐渐衍生出了多重耐药和广泛耐药的铜绿假单胞菌菌株，它们在全球范围内的广泛传播已对公共卫生构成了严重威胁。有数据表明在一些欧洲、美国等区域，多重耐药和广泛耐药的铜绿假单胞菌占比在15％～30％，2022年11月柳叶刀杂志上报道了2019年死于铜绿假单胞菌感染的人数高达55.9万。PA感染及其耐药性已经成为一个棘手的医学难题。
[0003]疫苗是预防和控制铜绿假单胞菌感染的重要手段。迄今为止，已有60余种候选PA疫苗进行了动物实验或临床人体试验，只有11种PA疫苗进入了临床试验阶段，按照抗原类别的不同，可将这11种PA疫苗分为五大类，分别是粘液胞外多糖类(MEP)、鞭毛类、外膜蛋白类、脂多糖类和灭活全菌类，但只有其中3种PA候选疫苗进入了Ⅲ期临床试验，即八价O/>‑
多糖
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外毒素A结合物His标记的外膜蛋白融合OprF
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OprI蛋白(IC43)和二价鞭毛蛋白疫苗，但是均因免疫原性弱或安全性不佳而失败，高效且安全的抗原递送载体可能是解决该问题的有效方法。
[0004]纳米颗粒是一个良好的递送系统，具有靶向递送、大小可调节性和稳定性良好等优点，最为重要的是，其作为载体递送抗原可增强其免疫原性和保护效果。
[0005]PcrV是PA
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型分泌系统(T3SS)的关键蛋白之一，位于T3SS针尖位置，可以控制效应蛋白的分泌，并且抗PcrV抗体能够抵御PA分泌的毒素，从而保护机体免受感染。基于PcrV抗原的候选疫苗在抵抗肺部和烧伤创面PA感染中提供了有效保护。OprI为PA的外膜脂蛋白，可促进IL
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12的产生，启动固有免疫和特异性T细胞应答，具有佐剂效应。
[0006]PA自身的分子伴侣蛋白GroEL保守性高，可自发形成生物相容性良好的纳米结构。研究表明GroEL免疫可有效抵御结核分枝杆菌、迟缓爱德华氏菌、伤寒沙门氏菌和志贺氏菌等感染，其为多数细菌的保护性抗原。

技术实现思路

[0007]针对铜绿假单胞菌的危害性，本专利技术提供一种铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白rePO
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GroEL，该蛋白由铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PcrV、OprI和PA热休克蛋白GroEL的有效成分构成，其可应用于制备铜绿假单胞菌纳米颗粒疫苗。
[0008]本专利技术首先提供了一种重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白，其由rePO、
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(Linker)n
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和GroEL依次连接组成，其中，rePO为铜绿假单胞菌PcrV与OprI融合抗原，Linker每次出现时各自独立地选自SEQ ID NO:5GGGGS、SEQ ID NO:6GGSGG和SEQ ID NO:7YAPVDV中的任一个，n为1、2、3或4，优选为1；
[0009]铜绿假单胞菌热休克蛋白为GroES或GroEL。
[0010]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述rePO的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述GroEL的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；GroES的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
[0012]在根据本专利技术的一个实施方案中，氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16。
[0013]本专利技术还提供了所述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:17。
[0014]本专利技术的再一方面提供了一种用于重组表达载体，其特征在于，包含上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白的编码基因，和表达质粒；所述表达质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或pQE系列载体中的任一种，优选为pET
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28a。
[0015]本专利技术进一步提供了一种用于表达上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白的重组菌株，其包含上述的重组表达载体和宿主菌；所述宿主菌选自大肠杆菌XL1
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blue菌株、BL21系列菌株和HMS174系列菌株中的任一种，优选为大肠杆菌BL21菌株。
[0016]本专利技术还提供了上述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0017]1)通过DNA合成和亚克隆方法构建表达上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白的编码基因的重组表达载体；优选地，所述重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白的编码基因为SEQ ID NO:1；
[0018]2)将步骤1)所获得的重组载体转化至宿主菌；
[0019]3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；
[0020]4)纯化重组蛋白，即得如上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白。
[0021]本专利技术的另一方面提供了上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白、重组基因、重组表达载体、或者重组菌株在制备抗铜绿假单胞菌的亚单位疫苗中的应用。
[0022]本专利技术还提供了一种用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的疫苗，其含有上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白。
[0023]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：
[0024]1)本专利技术的重组蛋白rePO
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GroEL在原核表达系统－大肠杆菌中诱导，以可溶形式表达；表达载体上接有一个由6个组氨酸残基链接上所组成的氨基酸序列(His6标签)，所表达的融合蛋白中就含有一个His标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和生物活性；纯化出来的rePO
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GroEL重组蛋白纯度大于93％；
[0025]2)本专利技术选择了铜绿假单胞菌编码蛋白的部分活性片段，基于重组蛋白亚单位的等电点、表面电荷、疏水性等性质，优选到PcrV、OprI和GroEL的连接方式，使用Gly
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Gly
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Gly
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Ser氨基酸序列作为Linker连接，更好的保留了所连接的两个蛋白的生物活性，减少了错误折叠的概率。该Linker中甘氨酸含量高，柔韧性强，可增加表位的可及性，避免错误折叠并提高O
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糖基化效率。
[0026]3)本专利技术rePO
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GroEL重组蛋白免本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白，其特征在于，由rePO、
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(Linker)n
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和铜绿假单胞菌热休克蛋白依次连接组成，其中，rePO为铜绿假单胞菌PcrV与OprI融合抗原，Linker每次出现时各自独立地选自SEQ ID NO:5GGGGS、SEQ ID NO:6GGSGG和SEQ ID NO:7YAPVDV中的任一个，n为1、2、3或4，优选为1；所述铜绿假单胞菌热休克蛋白为GroEL或GroES。2.如权利要求1所述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白，其特征在于，所述rePO的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。3.如权利要求1所述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白，其特征在于，所述GroEL的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；所述GroES的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。4.如权利要求1
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3中任一项所述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白的编码基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:17。6.一种用于重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求5所述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白的编码基因，和表达质粒；所述表达质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾江，魏玉洁，张怡，程新，廖亚玲，鲁东水，李宇航，高晨，张月月，曾浩，邹全明，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：