重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC-Ferritin及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC

【技术实现步骤摘要】
重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及制药
，具体涉及重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]2017年WHO发布了一份优先研发新抗生素的病原体清单，铜绿假单胞菌被列为“最危急”等级，它的出现和传播已成为严峻的公共卫生问题，主要有以下三个原因：第一，PA是一种条件致病菌，可对免疫功能受损或天然防御系统被破坏的患者造成严重感染，它是引起医院获得性肺炎的主要原因，有数据表明医院获得性肺炎患者的死亡率为13％到50％左右。第二，PA具有极强的耐药性。目前临床上主要使用抗生素进行治疗，但效果不佳，患者死亡率仍高达40.2％。第三，随着抗生素的使用，逐渐衍生出了多重耐药和广泛耐药的铜绿假单胞菌菌株，它们在全球范围内的广泛传播已对公共卫生构成了严重威胁。有数据表明在一些欧洲、美国等区域，多重耐药和广泛耐药的铜绿假单胞菌占比在15％～30％，2022年11月柳叶刀杂志上报道了2019年死于铜绿假单胞菌感染的人数高达55.9万。PA感染及其耐药性已经成为一个棘手的医学难题。
[0003]疫苗是预防和控制铜绿假单胞菌感染的重要手段。迄今为止，已有60余种候选PA疫苗进行了动物实验或临床人体试验，只有11种PA疫苗进入了临床试验阶段，按照抗原类别的不同，可将这11种PA疫苗分为五大类，分别是粘液胞外多糖类(MEP)、鞭毛类、外膜蛋白类、脂多糖类和灭活全菌类，但只有其中3种PA候选疫苗进入了Ⅲ期临床试验，即八价O
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多糖
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外毒素A结合物His标记的外膜蛋白融合OprF
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OprI蛋白(IC43)和二价鞭毛蛋白疫苗，但是均因免疫原性弱或安全性不佳而失败，高效且安全的抗原递送载体可能是解决该问题的有效方法。
[0004]纳米颗粒是一个良好的递送系统，具有靶向递送、大小可调节性和稳定性良好等优点，最为重要的是，其作为载体递送抗原可增强其免疫原性和保护效果。
[0005]铜绿假单胞菌拥有单根极端生鞭毛，鞭毛丝长度约6μm，直径约10nm。对革兰氏阴性菌而言，其鞭毛的总体结构高度保守，通常包括基体(basal body)、钩型鞘(hook)和鞭毛丝(filament)三个部分。鞭毛蛋白是鞭毛细丝部位的主要蛋白质成分，又FliC基因编码，可分为A型和B型两种血清型，具有很强的抗原性，该蛋白能够与黏蛋白和糖脂脱唾液酸等受体结合来诱发免疫反应，有利于介导机体的免疫应答。研究表明，PA鞭毛蛋白共同抗原表位具有的高度属特异性，可以利用该特异性进行细菌的鉴别以及疫苗等方面的研究。不仅如此，还可以从鞭毛的运动性等方面开展细菌感染的机理以及免疫机制等方面的研究。多项动物实验表明，基于鞭毛蛋白的疫苗可以有效抵御PA的感染。
[0006]铁蛋白广泛存在于多种属生物体中，包括细菌、真菌、植物、动物等。铁蛋白的主要生理功能是以不可溶的无毒形式将铁储存起来，同时将其转化为可溶形式来维持细胞内的生物可利用性，在铁稳态中具有重要作用。铁蛋白有许多独特的性质如自组装能力，热稳定
性，pH稳定性，单分散性，生物相容性，生物降解性，可解聚重组等。近年来在疫苗研发中有许多研究以铁蛋白纳米颗粒作为抗原展示平台，能够提高抗原的免疫原性。

技术实现思路

[0007]针对铜绿假单胞菌的严重危害，本专利技术提供一种重组铜绿假单胞菌自组装纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin，该蛋白由铜绿假单胞菌疫苗候选抗原A型鞭毛蛋白的有效成分FliC和铁蛋白纳米颗粒Ferritin的有效成分构成，其可应用于制备铜绿假单胞菌的自组装纳米颗粒疫苗。
[0008]本专利技术首先提供了一种重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin，其特征在于，由铁蛋白纳米笼、
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(Linker)n
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和铜绿假单胞菌A型鞭毛蛋白依次连接组成，Linker每次出现时各自独立地选自SEQ ID NO:5GGGGS、SEQ ID NO:6GGSGG和SEQ ID NO:7YAPVDV中的任一个，n为1、2、3或4，优选为1；
[0009]所述铜绿假单胞菌A型鞭毛蛋白为reFliC。
[0010]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述reFliC的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述Ferritin的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
[0012]在根据本专利技术的一个实施方案中，重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0013]本专利技术还提供了上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
[0014]本专利技术进一步提供了一种用于重组表达载体，其特征在于，包含上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin的编码基因，和表达质粒；所述表达质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或pQE系列载体中的任一种，优选为pET
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28a(+)。
[0015]本专利技术还提供了一种用于表达上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin的重组菌株，其特征在于，包含上述的重组表达载体和宿主菌；所述宿主菌选自大肠杆菌XL1
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blue菌株、BL21系列菌株和HMS174系列菌株中的任一种，优选为大肠杆菌BL21菌株。
[0016]本专利技术进一步提供了上述重组蛋白reFliC
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Ferritin的制备方法，包括以下步骤：
[0017]1)利用In
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Fusion法将reFliC基因片段和ferritin基因片段连接到载体质粒中构建得到表达如上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin的编码基因的重组表达载体；优选地，所述重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC
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Ferritin的编码基因为SEQ ID NO:1；
[0018]2)将步骤1)所获得的重组载体转化至宿主菌；
[0019]3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；
[0020]4)纯化重组蛋白，即得如上述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白；
[0021]优选地，步骤1)中是通过PCR分别扩增获得reFliC基因片段和ferritin基因片段，然后利用In
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Fusion酶，将上述eFliC基因片段和ferritin基因片段连接到载体质粒中；
[0022]更优选地，reFliC基因片段是利用由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
所述的重组铜绿假单胞菌纳米颗粒蛋白reFliC

【专利技术属性】
技术研发人员：顾江，魏玉洁，张怡，程新，廖亚玲，张卫军，曾升，李宇航，高晨，张译文，曾浩，邹全明，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：