在治疗HvG病中使用的融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供了融合蛋白，用于在接受了移植物的患者中治疗HvG病，用于抑制宿主的针对移植物的免疫应答。所述融合蛋白适用于在HLA

【技术实现步骤摘要】
在治疗HvG病中使用的融合蛋白
[0001]本申请是基于申请日为2017年6月22日，优先权日为2016年6月30日，申请号为201780041028.1，专利技术名称为：“在治疗HvG病中使用的融合蛋白”的专利申请的分案申请。
[0002]本专利技术涉及融合蛋白，其用于治疗接受了移植物的患者中的HvG病，用于抑制宿主的针对移植物的免疫应答。融合蛋白适用于在HLA
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A*02阴性的接受体(recipient)患者中抑制含有或表达作为人HLA
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A*02的MHC I类分子的移植物的免疫排斥，即移植前的患者不表达HLA
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A*02，或融合蛋白适用于抑制含有或表达作为猪SLA
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01*0401(猪白细胞抗原01*0401)的MHC I类分子的移植物的免疫反应。融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR
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A*02或CAR
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SLA
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01*0401)，其在调节性T细胞(T
reg
)中表达后分别在HLA
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A*02的存在下或在SLA
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01*0401的存在下引起调节性T细胞的特异性抑制物活性。本专利技术的CAR
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A*02和CAR
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SLA
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01*0401的优点是抑制物活性限于移植物并且导致移植物内细胞毒性T细胞的抑制，包括针对分别表达HLA
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A*02或SLA
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01*0401的移植物的细胞毒性T细胞。移植是一种实体组织。
[0003]融合蛋白包含下列各项或由下列各项组成：单链可变片段抗体域(scFv)、经修饰的hCD8铰链、hCD8跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导域，它们优选从N端到C端彼此连接，更优选从N端到C端彼此直接连接。
[0004]尤其在CAR
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SLA
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01*0401中，融合蛋白可以含有hΔFc IgG域作为经修饰的hCD8铰链的备选，和/或融合hCD28跨膜域
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hCD28/CD3 zeta域作为hCD8跨膜域的备选，胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导域。
[0005]此外，本专利技术涉及编码CAR融合蛋白的核酸序列，优选包含在病毒载体中，例如，在5'LTR和3'LTR之间，核酸序列更优选包含在适于转导Treg细胞的病毒颗粒中。其中，优选包含在病毒颗粒中的核酸序列和病毒载体用于治疗宿主抗移植物(HvG)病。根据本专利技术，HvG病的治疗通常是抑制针对移植的移植物的细胞毒性T细胞活性。
[0006]此外，本专利技术涉及用于引入分别对HLA
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A*02或SLA
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01*0401特异性的抑制物活性的体外方法，其通过在Treg细胞中表达根据本专利技术的融合蛋白，例如，通过将编码融合蛋白CAR
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A*02或CAR
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SLA
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01*0401的核酸序列导入Treg细胞中进行，所述Treg细胞通常不含或不表达HLA
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A*02或SLA
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01*0401，优选地，Treg细胞对患者是同基因的(homogeneic)，例如从患者的活组织检查中获得并分离。本专利技术提供了治疗HvG病的方法，其包括对患者施用表达本专利技术的融合蛋白CAR
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A*02或融合蛋白CAR
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SLA
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01*0401的Treg细胞。
现有技术
[0007]MacDonald et al.,The Journal of Clinical Investigation 1
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12(2016年3月22日)描述了具有对HLA
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A2特异性的scFv域的通用CAR，以及转导用于表达CAR以进行HLA
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A2特异性抑制的调节性T细胞。scFv域含有单克隆抗体BB7.2的重链和轻链可变区。除scFv外，CAR还含有CD28跨膜域、CD28信号传导域和CD3ζ信号传导域。
[0008]Inaguma et al.,Gene Therapy 575
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584(2014)描述了可用于使T淋巴细胞针对表达特定蛋白质的肿瘤细胞的T细胞受体的构建，包括分离当在HLA
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A2复合物中结合时对肿瘤特异性蛋白具有特异性的抗体scFv，以及使用scFv作为合成T细胞受体中的域。
[0009]Noyan et al.,Cancer Gene Therapy 19,352
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357(2012)描述了通过慢病毒转导在造血干细胞和祖细胞中诱导的转基因表达，用于治疗实体瘤。
[0010]Galla et al.,Nuc.Ac.Res.39,1721
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1731(2009)描述了用于通过逆转录病毒颗粒转导细胞的转座酶的细胞毒性效应。
[0011]DiStasi et al.,N Engl J Med 1673
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1683(2011)描述了通过引入编码胱天蛋白酶
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9二聚体的序列以产生细胞中可诱导凋亡的系统来进行遗传操作。
[0012]Long et al.,Diabetes,407
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415(2010)描述了用于测量IL
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2R的信号传导途径中的STAT5磷酸化的测定法。
[0013]Hombach et al.,Gene Therapy 1206
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1213(2010)描述了用于使T细胞针对特定抗原的CAR，所述CAR在scFv和跨膜域之间含有经修饰的IgG1 Fc间隔物，所述跨膜域与信号传导域附着(CD28
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CD3ζ)。
[0014]专利技术目的
[0015]本专利技术的目的是提供用于治疗HvG病的嵌合抗原受体CAR，其适于为Treg细胞提供对MHC I类，特别是对HLA
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A*02或对CAR
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SLA
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01*0401的抑制物活性，其足够强以抑制表达MHC I类，例如HLA
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A*02或SLA
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01*0401的移植物的细胞毒性排斥，尤其是在HLA
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A*02阴性的接受体患者中。
[0016]专利技术详述
[0017]本专利技术通过权利要求的特征实现了该目的，尤其是通过提供融合蛋白进行，所述融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)，尤其是含有对人HLA
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A*02特异性的scFv域的CAR
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A*02或含有对猪SLA
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01*0401特异性的scFv域的CAR
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SLA
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01*0401本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.融合蛋白在制备用于治疗患者中的HvG病的药物中的用途，所述融合蛋白包含单链可变片段抗体域(scFv)、铰链、跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导域，形成对HLA
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A*02具有特异性的嵌合抗原受体(CAR
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A*02)或者对SLA
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01*0401具有特异性的嵌合抗原受体(CAR
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SLA
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01*0401)，其特征在于所述融合蛋白在CD4
+
CD25
+
CD127
低
人调节性T(Treg)细胞中表达，表达CAR
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A*02的所述Treg为HLA
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A*02阴性并且经遗传操作以表达FOXP3。2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述铰链和所述跨膜域具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述hCD28信号传导域具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导域具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。3.根据权利要求1的用途，其特征在于所述铰链是具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的hΔFc IgG域。4.根据权利要求1的用途，其特征在于所述铰链和作为CD8跨膜域的所述跨膜域具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述hCD28信号传导域具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述hCD3ζ域具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或者包含hCD3ζ信号传导域的hCD28信号传导域具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。5.根据权利要求1的用途，其特征在于所述单链可变片段抗体域具有选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列。6.根据权利要求1的用途，其特征在于所述患者为HLA
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A*02阴性，并且所述患者含有或意图含有HLA
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A*02阳性的实体组织移植物。7.根据权利要求1的用途，其特征在于它从N端至C端包含下列各项或由下列各项组成：一个具有选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的scFv域、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的铰链和跨膜域、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的hCD28信号传导域、和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导域。8.根据权利要求1的用途，其特征在于所述融合蛋白从编码任选具有另外的N端分泌前导肽的所述融合蛋白的核酸序列表达。9.根据权利要求8的用途，其特征在于所述前导肽具有选自SEQ ID NO:24的氨基酸序列。10.根据权利要求1
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9中任一项的用途，其特征在于在HLA
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A*02阳性实体组织存在下向CD4
+
CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：布伦瑞克工业大学，
类型：发明
国别省市：