一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用。所述突变体与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比在第144位、第148位、第339位、第353位和第366位中的至少一位发生突变。本发明专利技术的荧光素酶融合蛋白突变体能与核酸探针进行高效的生物正交偶联，从而构建生物发光型核酸探针，有效解决了现有核酸荧光探针需要专业设备进行信号激发/接收、高背景和假阳性信号等问题。并且本发明专利技术的生物发光型核酸探针具有比率型的性质，不受环境以及底物消耗等因素的影响，为环境监测和疾病诊断等领域提供新方法和新工具。具。具。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用


[0001]本专利技术属于基因工程与生物检测
，具体涉及一种荧光素酶融合蛋白的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用。

技术介绍

[0002]深海虾细脚刺虾酶(Nano Luc luciferase,NLuc)是生物体内一种催化咪唑并吡嗪酮类化合物Furimazine氧化发光的一种荧光素酶，具有分子量小，发光效率高，稳定性好等特点。近年来，NLuc及其融合蛋白在科学研究和产业中得到了广泛的应用。
[0003]核酸探针(Nucleic Acid Sensor,NAS)技术是利用核苷酸碱基互补的原理，用特异的基因探针即识别特异靶标的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子。其靶标范围非常广，可用于金属离子、小分子、核酸分子、蛋白质、细胞甚至生物组织的检测。近年来，核酸探针在环境监测(重金属离子)、疾病检测、生物成像等领域发挥了重要作用。但是，目前的核酸探针普遍利用荧光作为信号输出策略，不仅需要专用设备进行信号激发/接收，而且复杂生物样品中的自发荧光将引起强烈的假阳性信号，不利于其分析检测应用。生物发光利用荧光素酶与底物的作用产生自发光，与荧光相比，生物发光不需要外部激发，可以有效解决核酸探针所面临的光漂白、背景信号、假阳性信号以及需要专业设备进行检测的缺点。因此，发展生物发光型核酸探针，用于生物样品定量检测是十分有必要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种荧光素酶融合蛋白(circular permutated Halo
‑
tag和circular permutated luciferase的融合蛋白，简写为cpHNLuc)的突变体及其构建的生物发光型核酸探针与应用，从而解决现有核酸探针存在的需要设备进行信号激发/接收、高背景和假阳性信号的问题。本专利技术通过对荧光素酶融合蛋白中的部分氨基酸位点进行突变，得到新型的荧光素酶融合蛋白突变体，再将该蛋白与核酸探针进行高效的生物正交偶联，作为通用性策略用于生物发光型核酸探针的构建。本专利技术构建的生物发光型核酸探针的响应信号变化明显、稳定，可广泛用于生物传感、分子诊疗等领域。
[0005]为实现上述技术目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种荧光素酶融合蛋白的突变体，所述突变体与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比在第144位、第148位、第339位、第353位和第366位中的至少一位发生突变。
[0007]所述第144位的突变优选为E144K；所述第148位的突变优选为E148K；所述第339位的突变优选为D339K；所述第353位的突变优选为E353K；所述第366位的突变优选为E366K。
[0008]本专利技术中，所述E144K即第144位氨基酸由E突变为K；所述E148K即第148位氨基酸由E突变为K；所述D339K即第339位氨基酸由D突变为K；所述E353K即第353位氨基酸由E突变为K；所述E366K即第366位氨基酸由E突变为K。
[0009]较佳地，所述突变体包含E144K、E148K中任一个，或包含E144K、E148K、D339K中的任意两个。
[0010]更佳的，所述突变体同时包含E144K、E148K和D339K，或同时包含E144K、E148K、D339K和E353K，或同时包含E144K、E148K、D339K、E353K和E366K。
[0011]本专利技术还提供一种分离的核酸，其编码如本专利技术第一方面所述的突变体；一些实施例中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID NO:3～10任一个所示。
[0012]本专利技术还提供一种重组表达载体，其包含本专利技术所述的分离核酸。一些实施例中，所述重组表达载体的骨架为pET28a质粒。
[0013]本专利技术还提供一种转化体，其含有本专利技术所述的分离的核酸，或本专利技术所述的重组表达载体。一些实施例中，所述转化体构建时使用的宿主细胞为大肠杆菌。一些具体实施例中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
[0014]本专利技术还提供一种制备本专利技术所述突变体的方法，其包括培养本专利技术所述的转化体得发酵产物，并从发酵产物中获得所述突变体。
[0015]第二方面，本专利技术提供一种生物发光型核酸探针的制备方法，包括如下步骤：
[0016]S1.对脱氧核酶(DNAzyme)进行修饰，得到修饰后的脱氧核酶；
[0017]S2.将步骤S1修饰后的脱氧核酶与如本专利技术第一方面所述突变体进行正交偶联，得到偶联产物；
[0018]S3.将步骤S2偶联产物与脱氧核酶底物链进行杂交，得到所述生物发光型核酸探针。
[0019]在一些实施例中，所述步骤S1中，脱氧核酶具有金属离子特异性响应性能。
[0020]在一些实施例中，所述步骤S1中，脱氧核酶的序列(5
’‑3’
)为：CACGT CCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTAGT
‑
NH2，如SEQ ID NO：21所示。
[0021]在一些实施例中，所述步骤S1中，用HaloTag配体分子对脱氧核酶进行修饰。
[0022]在一些实施例中，所述HaloTag配体分子的结构如下式所示:
[0023][0024]其中，n＝2或4，优选n＝4。
[0025]在一些实施例中，所述HaloTag配体分子通过商业途径购买得到或通过现有技术方法合成。
[0026]在一些具体实施例中，所述步骤S1中，用HaloTag配体分子对脱氧核酶进行修饰的具体过程为：将HaloTag配体分子与脱氧核酶溶于硼酸缓冲溶液中，于25～40℃，160～200rpm震荡过夜反应，得到修饰后的脱氧核酶。
[0027]在一些具体实施例中，所述硼酸缓冲溶液含有50mM硼酸钠，pH为8.5。
[0028]在一些实施例中，所述步骤S2中，修饰后的脱氧核酶与突变体进行正交偶联的具体过程为：将修饰后的脱氧核酶与突变体按照(1～3):1μM浓度比例在Tris
‑
NaCl缓冲溶液中混合，室温孵育1～2h，得到偶联产物。
[0029]在一些实施例中，所述Tris
‑
NaCl缓冲溶液含有50mM Tris与100mM NaCl，pH为7.4。
[0030]在一些实施例中，所述步骤S3中，脱氧核酶底物链序列(5
’‑3’
)为：ACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG(其中rA为腺苷)，如SEQ ID NO：22所示。
[0031]在一些实施例中，所述步骤S3中，脱氧核酶底物链5
’
端带有荧光团修饰，荧光团可选地为FITC(荧光素)，Cy3，TAMRA(二甲基罗丹明),优选为Cy3。
[0032]在一些实施例中，所述步骤S3中，偶联产物与脱氧核酶底物链进行杂交的具体实施过程为：将偶联产物用所述Tris本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光素酶融合蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比在第144位、第148位、第339位、第353位和第366位中的至少一位发生突变；所述第144位的突变为E144K；所述第148位的突变为E148K；所述第339位的突变为D339K；所述第353位的突变为E353K；所述第366位的突变为E366K。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含以下1)
‑
8)中的任一种：1)E144K；2)E148K；3)E144K和E148K；4)E144K和D339K；5)E148K和D339K；6)E144K、E148K和D339K；7)E144K、E148K、D339K和E353K；8)E144K、E148K、D339K、E353K和E366K。3.一种分离的核酸，其编码如权利要求1或2所述的突变体；所述核酸的碱基序列如SEQ ID NO:3～10任一个所示。4.一种生物发光型核酸探针的制备方法，包括如下步骤：S1.对脱氧核酶进行修饰，得到修饰后的脱氧核酶；S2.将步骤S1修饰后的脱氧核酶与如权利要求1或2所述突变体进行正交偶联，得到偶联产物；S3.将步骤S2偶联产物与脱氧核酶底物链进行杂交，得到所述生物发光型核酸探针。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，脱氧核酶的序列(5
’‑3’
)为：CACGTCCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTAGT
‑
NH2，如SEQ ID NO：21所示；所述HaloTag配体分子的结构如下式所示：其中，n＝2或4；用所述HaloTag配体分子对脱氧核酶进行修饰的具体过程为：将HaloTag配体分子与脱氧核酶溶于硼酸缓冲溶液中，于25～40℃，16...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊梦仪，张晓兵，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：