一种基于化疗-基因治疗协同的无载体纳米粒及其制备和抗肝癌应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于化疗

【技术实现步骤摘要】
一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒及其制备和抗肝癌应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒及其制备和抗肝癌应用。

技术介绍

[0002]肝癌发病隐匿，早期诊断困难，治疗棘手，复发率和恶性程度高，每年新增病例及死亡病例居高不下，常年威胁着人类生命健康。目前，肝癌的临床治疗多采取手术切除、化疗和放疗等方式为主的综合治疗方式。随着各种小分子药物的发现与研发，当前已有多种药物用于肝癌化疗。但因大部分药物靶向效率低、副作用大，传统化疗药物应用于肝癌的治疗效果依旧不容乐观。
[0003]索拉非尼(Sorafenib,SF)是一种小分子靶向多激酶抑制剂，具有多机制抑制肝癌细胞增殖能力，抗肝癌疗效显著，目前已成为中晚期肝癌的首选化疗药物。熊果酸(Ursolic acid,UA)是一种天然植物来源的三萜类化合物，近年来在抗肿瘤领域发挥了不可小视的作用，其低毒高效，作用温和，可以作为安全的潜在药物应用于肿瘤治疗。然而，这两种药物仍存在水溶性差、生物利用度低和易产生耐药等缺陷。目前已有研究者探究了两种或以上化疗药物联用的方法，以减少单一药物用量而降低毒副作用和耐药作用。中国专利CN201610518377.5公开了一种含熊果酸与索拉非尼的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该组合物在肝癌治疗中展现了低毒高效的优势。此外，中国专利CN202111598274.1公开了一种无载体双药自组装纳米粒的制备及用途，将熊果酸与索拉非尼自组装形成纳米粒，有效避免了传统高分子或无机载体带来的潜在毒性。由此可见，多药联用的自组装纳米可能成为一种有效的肝癌治疗策略。
[0004]基因治疗，即将治疗性核酸引入靶细胞或生物体，纠正或补偿缺陷、异常基因引起的疾病，从而达到治疗目的。这一疗法近年来逐渐成为研究焦点，为肿瘤疾病提供了治疗新策略。其中，CRISPR/Cas9系统是可以快速便捷地对基因组进行精确编辑的系统，能够直接作用于肿瘤细胞，实现关键致癌基因定点敲除。近年来，该技术与传统肿瘤治疗方法联用的诊治模式已经开展了广泛的研究，发挥化疗与基因治疗两者的协同作用，充分改善肿瘤治疗效果，是一种具有十足潜力的抗癌策略。
[0005]纳米医药技术的发展为肿瘤治疗带来了新的机遇和挑战，通过构建纳米递药系统，能够大大提高多种抗肿瘤药物的生物利用度，充分改善肿瘤治疗效果。但大多外源性纳米载体仍然存在载药量低、生物相容性差等问题。无载体自组装概念为抗癌药物研发提供了新思路，通过药物自组装制备的递送系统，其复合物既是载体又是药物本身，具有高载药量、低毒副作用等优势。当前，基于基因
‑
化疗联用的纳米药物体系构建多以外源性材料作为药物载体。中国专利201810781142.4公开了一种基于适配体修饰的中空介孔二氧化硅共载质粒的多功能纳米药物的制备及其应用，使用中空介孔二氧化硅为药物载体，同时包载索拉非尼与EGRF
‑
sgRNA/Cas9质粒，以达到两者协同抗肿瘤作用。中国专利
CN202210130435.2公开了一种基因编辑递送系统及其制备方法和应用，以膜融合脂质体外层包裹在钙沉淀杂化基因编辑质粒内核的表面，实现CRISPR/Cas9质粒递送。然而，基于无载体自组装技术的基因
‑
化疗联用的纳米药物体系用于肝癌的协同治疗尚未见报道。
[0006]基于上述研究背景，本专利技术拟构建基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米递送系统，该系统借助两种疏水性药物的分子间作用力，自发组装形成纳米内核，并引入CRISPR/Cas9系统组分，以实现基因治疗和化疗的有效协同，此外，纳米粒子外层包覆肝癌细胞来源的仿生细胞膜，使其具有肿瘤同源靶向及免疫逃逸作用。本专利技术提供的基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒，将化疗与基因治疗联合，克服传统单药治疗的局限性，并避免了传统纳米载体的可能存在的问题，在肝癌治疗方面具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒及其制备方法及和抗肝癌应用。本专利技术通过疏水性药物分子自组装构筑具有双药协同作用的纳米内核1，并以正电荷蛋白为辅剂，将纳米内核1通过π
‑
π堆积，静电作用力、疏水相互作用与基因编辑组分共组装，得到兼具双药协同作用和基因治疗能力的纳米内核2，再在纳米内核2外层包覆肿瘤细胞源的细胞膜，使其具有良好的肿瘤识别能力和免疫逃逸功能，即得到所述基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒。该无载体纳米粒整合了化疗
‑
基因疗法联合应用策略，实现了更好的肿瘤抑制效果。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒，所述无载体纳米粒包括内核和包覆于内核外的外壳，所述内核是以正电荷蛋白为辅剂、由疏水性天然产物、疏水性抗肿瘤药物与CRISPR系统Cas9/RNP复合物通过多重配位、π
‑
π堆积、静电和疏水作用力共组装而成，所述外壳为肿瘤细胞膜；其中，所述疏水性天然产物为熊果酸，所述疏水性抗肿瘤药物为索拉非尼，所述正电荷蛋白为硫酸鱼精蛋白，所述CRISPR系统Cas9/RNP复合物包括Cas9蛋白和特异性靶向PD
‑
L1基因的sgRNA，所述肿瘤细胞膜为HepG2人肝癌细胞的细胞膜；其中，所述sgRNA的序列为5
’‑
CACCGCAAGGCCGAAGTCATCTGGA
‑3’
，所述Cas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]其中，所述无载体纳米粒的粒径为170～200nm。
[0010]上述一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：(1)将一定量的熊果酸和索拉非尼分别溶于甲醇和乙醇中，得到熊果酸
‑
甲醇溶液和索拉非尼
‑
乙醇溶液；(2)将一定量的熊果酸
‑
甲醇溶液和索拉非尼
‑
乙醇溶液混合均匀，滴加至去离子水中，得到US NPs溶液；(3)将一定量的Cas9/RNP复合物和硫酸鱼精蛋白分别溶于水中，得到Cas9/RNP复合物水溶液和硫酸鱼精蛋白水溶液；(4)将一定量的Cas9/RNP复合物水溶液与硫酸鱼精蛋白水溶液混合均匀，将该混合液滴加至步骤2)所制得的US NPs溶液中，得到USPR NPs溶液；将所制得的USPR NPs溶液冷冻干燥，得USPRNPs冻干粉；
(5)将一定量肿瘤细胞膜冻干粉与一定量USPR NPs冻干粉混合，共同溶解至去离子水中，通过水相微孔滤膜过滤，离心，即获得所述基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒；其中，步骤(1)中，所述熊果酸
‑
甲醇溶液中熊果酸的浓度为4mg/mL，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒，其特征在于：所述无载体纳米粒包括内核和包覆于内核外的外壳，所述内核是以正电荷蛋白为辅剂、由疏水性天然产物、疏水性抗肿瘤药物与CRISPR系统Cas9/RNP复合物通过多重配位、π
‑
π堆积、静电和疏水作用力共组装而成，所述外壳为肿瘤细胞膜；其中，所述疏水性天然产物为熊果酸，所述疏水性抗肿瘤药物为索拉非尼，所述正电荷蛋白为硫酸鱼精蛋白，所述CRISPR系统Cas9/RNP复合物包括Cas9蛋白和特异性靶向PD
‑
L1基因的sgRNA，所述肿瘤细胞膜为HepG2人肝癌细胞的细胞膜。2.根据权利要求1所述的一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒，其特征在于：所述sgRNA的序列为5
’‑
CACCGCAAGGCCGAAGTCATCTGGA
‑3’
，所述Cas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的一种基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒，其特征在于：所述无载体纳米粒的粒径为170~200 nm。4.一种如权利要求1所述的基于化疗
‑
基因治疗协同的无载体纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将熊果酸和索拉非尼分别溶于甲醇和乙醇中，得到熊果酸
‑
甲醇溶液和索拉非尼
‑
乙醇溶液；2）将1体积份熊果酸
‑
甲醇溶液和1体积份索拉非尼
‑
乙醇溶液混合均匀，加入至18体积份去离子水中，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵敬伟，张冰晨，李林燕，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：