用于制备脂质纳米颗粒的高通量方法及其用途技术

本文提供了用于优化和制造各种脂质纳米颗粒(LNP)组合物的高通量方法及其用途。例如，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制造LNP组合物的高通量筛选方法，所述方法包括：获得包含有效载荷和多个能够自组装的分子的至少两种可混合的溶液，并在一组受控条件下混合所述至少两种溶液，其中注入顺序、速度、体积、相比率和混合持续时间是不同的。在各种实施方案中，本公开使得能够确定最优封装效率、粒径分布、纯化和颗粒回收率以及配制物稳定性。本文公开的方法使得能够有效优化用于制备基于LNP的治疗剂的制造条件。LNP的治疗剂的制造条件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备脂质纳米颗粒的高通量方法及其用途
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年12月9日递交的美国临时专利申请第63/123,343号的优先权和权益，该美国临时专利申请的全部内容出于所有目的通过援引全部并入本文。

技术介绍

[0003]脂质纳米颗粒(LNP)已被广泛开发为生物相容的且稳定的药物递送平台。用于制备脂质纳米颗粒的脂质通常为低毒性的生理性脂质(具有生物相容性和可生物降解性)。脂质的理化多样性和生物相容性以及其增强药物的口服生物利用度的能力，使脂质纳米颗粒成为非常有吸引力的药物递送载体。此外，基于脂质的配制物可通过多种方式对药物吸收产生积极影响，包括：提高溶解能力、防止药物在肠道稀释时沉淀、增强膜通透性、抑制外流性转运蛋白、减少CYP酶、增强乳糜微粒的产生和淋巴转运。LNP为用于siRNA递送的主要非病毒载体，截至2019年被用于70％的纳米医学临床试验。Anselmo S等人,2019,Bioeng.Transl.Med.4(3):e10143。
[0004]由于其复杂的理化性质，基于脂质的纳米载体给药品的质量控制带来了额外的挑战。根据美国FDA最近发布的脂质体药品指南，这些配制物应明确以下质量属性：颗粒结构和粒径分布、颗粒表面理化性质、脂质含量、游离API含量和封装效率以及物理和化学稳定性。不同的制备条件和参数可能影响LNP配制物的质量属性。例如，脂质组合物，特别是掺入不同含量和/或分子量的经聚乙二醇化的脂质，显著影响脂质体的胶体稳定性、细胞吸收和药物动力学(参见例如Allen等人,1991,Biochem Biophys Acta,1066(1):29
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36；Garbuzenko等人,2005,Chem Phys Lipids,135(2):117
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29；Immordino等人,Int J Nanomedicine 1(3)(2006)297
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315)，而siRNA或ASO载量可通过电荷所介导的与阳离子脂质的相互作用进行控制。Schroeder等人,2010,J Intern Med 267(1):9
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21；Cullis等人,2017,Mol Ther25(7):1467
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1475。LNP的下游性能也受其质量属性高度控制。因此，筛选各种水平的这些参数非常需要一种具有简便程序和多种分析输出的高通量方法。

技术实现思路

[0005]为解决筛选并优化基于脂质的纳米医学的需求，本公开提供了一种用于制备该封装各种治疗有效载荷的基于脂质的纳米颗粒的高通量筛选(HTS)工作流程。在各种实施例中，本专利技术提供了一种使用机器人液体处理器促进LNP的自组装的优化溶剂注入方法。在各种实施例中，阐述了最佳脂质组合物、总脂质浓度和有效载荷的载量。
[0006]在各种实施例中，本公开涉及一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中该第一溶液和该第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于该第一溶液或该第二溶液中；d.使用机器人液体处理器制备具有不同组成的该相并将该相分配至多个孔中；e.在适合LNP形成的条件下，使用该机器人液体处理器混合该第一溶液和该第二溶液以获得封装该有效载荷的脂质纳米颗粒；其中不同孔之
间，以下条件中的至少一者是不同的：自组装分子的类型，该自组装分子的组成比率；该自组装分子与该有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲剂类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间和混合持续时间；f.测量以下中的至少一者：该LNP的封装效率、粒径分布、纯化和颗粒回收率以及配制物稳定性；g.确定用于制造该LNP制剂的最优参数；以及h.基于该最优参数制造该LNP制剂。
[0007]在各种实施例中，该有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，该寡核苷酸为反义分子。在各种实施例中，该寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，该寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，该寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，该有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的大小为约500至约3000个核苷酸。在各种实施例中，该有效载荷为多肽。在各种实施例中，该多肽在约1000Da与约10000Da之间。在各种实施例中，该有效载荷为小分子。在各种实施例中，该小分子在约100Da与1000Da之间。
[0008]在各种实施例中，该有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，该有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，该第一溶液为水性缓冲剂。在各种实施例中，该第一溶液包含pH受控缓冲剂和渗透压受控缓冲剂。在各种实施例中，该第二溶液的有机相包含甲醇。在各种实施例中，该第二溶液的有机相包含乙醇。
[0009]在各种实施例中，自组装分子至少包含脂质组分，该脂质组分包含至少一种脂质分子。在各种实施例中，该至少一种脂质分子选自阳离子或可电离脂质种类、非阳离子脂质种类和磷脂质种类。在各种实施例中，该第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，该脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，该脂质的总浓度在约0.4mM与约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，该有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
[0010]在各种实施例中，该LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，该LNP为脂质体。在各种实施例中，该LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，该第一溶液被注入该第二溶液中。在各种实施例中，该第二溶液被注入该第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷的封装效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80nm至200nm、具有单峰粒径分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，该LNP储存于4摄氏度的溶液中时，维持相似的粒径分布和有效载荷封装至少一个月。
[0011]在各种实施例中，本公开涉及一种优化用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的制程的高通量方法，其包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中该第一溶液和该第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于该第一溶液或该第二溶液中；d.使用机器人液体处理器制备具有不同组成的该相并将该相分配至多个孔中；e.在适合LNP形成的条件下，使用该机器人液体处理器混合该第一溶液和该第二溶液以获得封装该有效载荷的脂质纳米颗粒；其中不同孔之间，以下条件中的至少一者是不同的：自组装分子的类型，该自组装分子的组成比率；该自组装分子与该有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲剂类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间和混合持续时间；f.测量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，所述方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；d.使用机器人液体处理器制备具有不同组成的所述相并将所述相分配至多个孔中；e.在适合LNP形成的条件下，使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得封装所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中不同孔之间，以下条件中的至少一者是不同的：自组装分子的类型，所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲剂类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间和混合持续时间；f.测量以下中的至少一者：所述LNP的封装效率、粒径分布、纯化和颗粒回收率以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。6.根据权利要求2至5所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。8.根据权利要求7所述的方法，其中mRNA的大小为长度约500至约3000个核苷酸。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述小分子在约100Da与1000Da之间。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲剂。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控缓冲剂和渗透压受控缓冲剂。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包含甲醇。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包含乙醇。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述自组装分子至少包含脂质组分，所述脂质组分包含至少一种脂质分子。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种脂质分子选自由阳离子脂质种类、可电离脂质种类、非阳离子脂质种类、磷脂质种类和非磷脂质种类组成的组。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
22.根据权利要求1所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述脂质的总浓度在约0.4mM与约4mM之间变化。24.根据权利要求1所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。26.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。29.根据权利要求1至27所述的方法，其中所述LNP为脂质体。30.根据权利要求1至27所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。31.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液被注入所述第二溶液中。32.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二溶液被注入所述第一溶液中。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的封装效率的那些参数。34.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80nm至200nm、具有单峰粒径分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。35.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述LNP储存于4摄氏度的溶液中时，维持相似的粒径分布和有效载荷封装至少一个月。36.一种优化用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的制程的高通量方法，所述方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；d.使用机器人液体处理器制备具有不同组成的所述相并将所述相分配至多个孔中；e.在适合LNP形成的条件下，使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得封装所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中不同孔之间，以下条件中的至少一者是不同的：自组装分子的类型，所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲剂类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间和混合持续时间；f.测量以下中的至少一者：所述LNP的封装效率、粒径分布、纯化和颗粒回收率以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。39.根据权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。40.根据权利要求38所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。41.根据权利要求37至42所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷
酸之间。42.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。43.根据权利要求42所述的方法，其中mRNA的大小为约1kb至约2kb。44.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。45.根据权利要求45所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。46.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述小分子在约100Da与1000Da之间。48.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。49.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。50.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲剂。51.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控缓冲剂和渗透压受控缓冲剂。52.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包含甲醇。53.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包含乙醇。54.根据权利要求36所述的方法，其中所述自组装分子至少包含脂质组分，所述脂质组分包含至少一种脂质分子。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述至少一种脂质分子选自阳离子脂质种类、非阳离子脂质种类和磷脂质种类。56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。57.根据权利要求36所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述脂质的总浓度在约0.4mM与约4mM之间变化。59.根据权利要求54或55所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。61.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。63.根据权利要求36至62中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。64.根据权利要求36至62所述的方法，其中所述LNP为脂质体。65.根据权利要求36至62所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。66.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一溶液被注入所述第二溶液中。67.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二溶液被注入所述第一溶液中。68.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的封装效率的那些参数。69.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80nm至200nm、具有单峰粒径分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。70.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述LNP储存于4摄氏度的溶液中时，维持相似的粒径分布和有效载荷封装至少一个月。71.一种用于将有效载荷封装于液体纳米颗粒(LNP)制剂中的经优化的高通量方法，所
述方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；d.使用机器人液体处理器制备具有不同组成的所述相并将所述相分配至多个孔中；e.在适合LNP形成的条件下，使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得封装所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中不同孔之间，以下条件中的至少一者是不同的：自组装分子的类型，所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲剂类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间和混合持续时间；f.测量以下中的至少一者：所述LNP的封装效率、粒径分布、纯化和颗粒回收率以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。72.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。73.根据权利要求72所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。74.根据权利要求73所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。75.根据权利要求73所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。76.根据权利要求72至75所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。77.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。78.根据权利要求77所述的方法，其中mRNA的大小为约1kb至约2kb。79.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。80.根据权利要求79所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。81.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。82.根据权利要求81所述的方法，其中所述小分子在约100Da与1000Da之间。83.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。84.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。85.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲剂。86.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控缓冲剂和渗透压受控缓冲剂。87.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包含甲醇。88.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包含乙醇。89.根据权利要求71所述的方法，其中所述自组装分子至少包含脂质组分，所述脂质组分包含至少一种脂质分子。90.根据权利要求89所述的方法，其中所述至少一种脂质分子选自阳离子脂质种类、非阳离子脂质种类和磷脂质种类。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。92.根据权利要求89或90所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。93.根据权利要求92所述的方法，其中所述脂质的总浓度在约0.4mM与约4mM之间变化。94.根据权利要求89或90所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。95.根据权利要求94所述的方法，其中所述经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。96.根据权利要求72至78中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。97.根据权利要求96所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。98.根据权利要求71至97中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。99.根据权利要求71至97所述的方法，其中所述LNP为脂质体。100.根据权利要求71至97所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。101.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一溶液被注入所述第二溶液中。102.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二溶液被注入所述第一溶液中。103.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的封装效率的那些参数。104.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80nm至200nm、具有单峰粒径分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。105.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述LNP储存于4摄氏度的溶液中时，维持相似的粒径分布和有效载荷封装至少一个月。106.一种向有此需要的患者施用LNP制剂的方法，其中所述LNP制剂通过以下制造：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；d.使用机器人液体处理器制备具有不同组成的所述相并将所述相分配至多个孔中；e.在适合LNP形成的条件下，使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得封装所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中不同孔之间，以下条件中的至少一者是不同的：自组装分子的类型，所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲剂类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间和混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：