一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，属于纳米药物制备领域。本发明专利技术设计了一种响应脑卒中组织微环境中活性氧的，由芬戈莫德聚合物“内核”和中性粒细胞膜“外壳”组成的聚合前药纳米载体用于特异性递送芬戈莫德，以对抗缺血性脑卒中局部炎症对神经系统的损伤。该纳米药物递送平台通过中性粒细胞膜的炎症趋向作用极大地提高药物分子芬戈莫德的卒中部位靶向效率和局部浓度。此外，通过靶向给药和响应性释放等性质，该纳米载体可以显著降低芬戈莫德的毒副作用。本发明专利技术的药物芬戈莫德会介导小胶质细胞由促炎症的M1型向抑炎症的M2型转化，从而减轻脑卒中部位脑实质的炎症，改善卒中部位神经系统损伤，促进神经功能缺损的恢复等。经功能缺损的恢复等。经功能缺损的恢复等。
【技术实现步骤摘要】
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技术实现思路
[0015]本专利技术的目的是为了规避芬戈莫德的毒副作用，解决芬戈莫德靶向性不强的问题，提供一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法。
[0016]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0017]一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，所述方法为：
[0018]步骤一：制备活性氧响应的芬戈莫德单体
[0019](1)制备活性氧响应连接体：将3
‑
巯基丙酸与三氟乙酸溶解于无水丙酮中，室温搅拌过夜，将白色沉淀过滤收集并用正己烷和冰水清洗即得到活性氧响应连接体；
[0020](2)将活性氧响应连接体连接到芬戈莫德分子上：活性氧响应连接体与N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶于N，N
‑
二甲基甲酰胺中，再加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC
·
HCl)或N，N'
‑
二环己基碳酰亚胺(DCC)，盐酸调节pH到4.3
‑
4.5反应后逐滴加入盐酸芬戈莫德，随后加入三乙胺调节pH到7
‑
7.4，室温搅拌12
‑
24小时后加水沉淀并离心，弃掉上清收集沉淀干燥即得到活性氧响应的芬戈莫德；
[0021](3)制备活性氧响应的芬戈莫德单体：活性氧响应的芬戈莫德与NHS溶于DMF中，再加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC
·
HCl)或N，N'
‑
二环己基碳酰亚胺(DCC)，调节pH到4.3
‑
4.5反应30min后逐滴加入2
‑
氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐，随后加入三乙胺调节pH到7
‑
7.4，室温搅拌12
‑
24小时后加水沉淀并离心，弃掉上清收集沉淀干燥即得到活性氧响应的芬戈莫德单体；
[0022]步骤二：制备PEG
‑
Polyfingolimod两亲聚合物
[0023]聚乙二醇
‑4‑
氰基
‑4‑
(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯，活性氧响应的芬戈莫德单体和AIBN溶解于二氧六环溶液中75
‑
85℃反应24h，透析后去离子水沉淀冻干即得到聚合物；
[0024]步骤三：制备包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德前药纳米粒子
[0025](1)组装：取0.1
‑
10mg的PEG
‑
Polyfingolimod两亲聚合物溶于900μL的四氢呋喃(THF)中，并在磁力搅拌器搅拌过程中逐滴加入100
‑
1000μL去离子水，并将其置于室温下持续搅拌，鉴于THF具有挥发性，故随着THF的挥发，溶液中的PEG
‑
Polyfingolimod两亲聚合物发生自组装，得到球状的纳米前药粒子；
[0026](2)中性粒细胞膜的提取：将细胞悬浮在预冷的低渗裂解缓冲液(提前4℃预冷30min)中，使用带有紧杵的杜恩斯匀浆机将细胞打乱(50
‑
100次)，匀浆在20000
×
g，4℃离心25min，丢弃颗粒，上清再次在100000
×
g，4℃下离心35min，收集颗粒，使用含有0.2mM EDTA洗涤两遍，使用BCA试剂盒(Pierce)参照牛血清白蛋白(BSA)标准定量膜含量：大约1.25亿个人中性粒细胞或2亿个小鼠中性粒细胞能够产生1毫克的膜材料(蛋白质重量)，用0.2mM EDTA将膜悬浮到4mg/mL，并在80℃下保存以备后续研究；
[0027](3)纳米粒子包膜：在室温下，将1mg以上的细胞膜悬浮在1mL水中，在有盖的离心管中超声，超声给予能量能促使二者实现包覆，将1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，其特征在于：所述方法为：步骤一：制备活性氧响应的芬戈莫德单体(1)制备活性氧响应连接体：将3
‑
巯基丙酸与三氟乙酸溶解于无水丙酮中，室温搅拌过夜，将沉淀过滤收集并用正己烷和冰水清洗即得到活性氧响应连接体；(2)将活性氧响应连接体连接到芬戈莫德分子上：活性氧响应连接体与N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶于N，N
‑
二甲基甲酰胺中，再加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或N，N'
‑
二环己基碳酰亚胺，调节pH到4.3
‑
4.5反应后逐滴加入盐酸芬戈莫德，随后加入三乙胺调节pH到7
‑
7.4，室温搅拌12
‑
24小时后加水沉淀并离心，弃掉上清收集沉淀干燥即得到活性氧响应的芬戈莫德；(3)制备活性氧响应的芬戈莫德单体：活性氧响应的芬戈莫德与NHS溶于DMF中，再加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或N，N'
‑
二环己基碳酰亚胺，调节pH到4.3
‑
4.5反应30min后逐滴加入2
‑
氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐，随后加入三乙胺调节pH到7
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7.4，室温搅拌12
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24小时后加水沉淀并离心，弃掉上清收集沉淀干燥即得到活性氧响应的芬戈莫德单体；步骤二：制备PEG
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Polyfingolimod两亲聚合物聚乙二醇
‑4‑
氰基
‑4‑
(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯，活性氧响应的芬戈莫德单体和AIBN溶解于二氧六环溶液中75
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85℃反应24h，透析后去离子水沉淀冻干即得到聚合物；步骤三：制备包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德前药纳米粒子(1)组装：取0.1
‑
10mg的PEG
‑
Polyfingolimod两亲聚合物溶于900μL的四氢呋喃中，并在搅拌过程中逐滴加入100
‑
1000μL去离子水，并将其置于室温下持续搅拌，得到球状的纳米前药粒子；(2)中性粒细胞膜的提取：将细胞悬浮在预冷的低渗裂解缓冲液中，将细胞打乱，匀浆离心，丢弃颗粒，上清再次离心，收集颗粒，使用含有0.2mMEDTA洗涤两遍，用0.2mMEDTA将膜悬浮到4mg/mL，并在80℃下保存；(3)纳米粒子包膜：在室温下，将1mg以上的细胞膜悬浮在1mL水中，在有盖的离心管中超声，将10
‑
20mg/mL中性粒细胞膜与10
‑
20mg/mL纳米粒按膜芯重量比1：1混合，然后在冰上再次超声，离心去上清，收集沉淀即为包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德前药纳米粒子。2.根据权利要求1所述的一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨奎琨，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：
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