甘草酸改性脂质纳米颗粒的制备方法及其在核酸药物递送中的应用技术

本发明专利技术提供了一种应用于核酸药物递送的高效、低毒的甘草酸改性脂质纳米颗粒载药系统的制备方法。本发明专利技术所报道的脂质纳米颗粒制剂配方，首次利用甘草酸掺杂法对传统脂质纳米颗粒配方进行改性。甘草酸具有抗炎、抗病毒、抗增殖、保护肝脏、抗氧化等作用。与脂质纳米颗粒相比，甘草酸改性脂质纳米颗粒的免疫原性和细胞毒性更低。制备的甘草酸改性脂质纳米颗粒具有粒径均一、分散可控、高稳定性等特点，在体内外均具有较高的核酸递送效率和生物相容性，制备工艺可控性强，是一种安全有效的核酸递送系统，具有潜在的临床应用价值。具有潜在的临床应用价值。具有潜在的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
甘草酸改性脂质纳米颗粒的制备方法及其在核酸药物递送中的应用


[0001]本专利技术属于药学、生物学、化学领域，具体的涉及一种应用于核酸药物递送的高效、低毒的甘草酸改性脂质纳米颗粒载药系统的制备方法。

技术介绍

[0002]脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle，LNP)，也叫脂质体。因其对强疏水性或强亲水性等具有较差的药代动力学(PK)特性或成药性参数不理想的化合物，包括小分子、蛋白质和核酸等分子具有高效地体内递送能力而成为一种用途极其广泛的药物载体。而大多数天然产物或者和中药单体化合物确实具有出色的体外活性，但较差的药代动力学特性阻碍了其成为上市药物的步伐。因此，LNPs 转运的天然产物可以带来重要的药学性质改善。
[0003]近年来用于递送核酸药物的阳离子脂质纳米颗粒是由人工设计合成的阳离子脂质和中性脂质组成，是核酸药物最广泛使用的非病毒给药系统，然而，非天然阳离子化合物具有一定的免疫原性，其免疫原性极有可能引起细胞毒性。用于核酸递送的阳离子脂质纳米颗粒的经典配方中包含胆固醇。甘草酸 (glycyrrhizinic acid，GA)的化学结构类似于胆固醇，它包含一个脂肪族环的疏水性支架和一个糖苷链的亲水性基团，这种结构使甘草酸很容易作为一种类脂质包封在LNP中。
[0004]GA是具有多种生物学活性的一类三萜皂苷类化合物，包括抗炎、抗病毒、抗增殖、保护肝脏、抗氧化等。且甘草酸二铵已成为治疗慢性肝炎的临床药物。但由于甘草酸本身溶解性和渗透性差、代谢迅速且生物利用度差，GA作为一种有效的治疗药物也有其局限性。
[0005]因此，本专利技术用GA掺杂法对传统LNPs配方进行改性，具有减轻传统脂质纳米粒的免疫原性、降低阳离子脂质的细胞毒性和改善生物相容性的作用，因此GA改性LNP是一种安全有效的核酸递送策略。
[0006]本专利所报道的LNP的制剂配方，首次提出将甘草酸作为辅助材料用于 LNP配方的改性，经过配方优化，所制备的脂质纳米颗粒具有粒径均一、分散可控、高稳定性、低免疫原性、低细胞毒性，在体内体外均具有较高的核酸递送效率等特点，制备工艺可控性强，具有潜在的临床应用价值。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于提供一种应用于核酸药物递送的高效、低毒的甘草酸改性脂质纳米颗粒载药系统的制备方法。所报道的纳米颗粒制剂配方，首次利用甘草酸掺杂法对传统脂质纳米颗粒配方进行改性，发挥甘草酸抗炎、抗病毒、抗增殖、保护肝脏、抗氧化等作用，减轻传统脂质纳米粒的免疫原性、降低阳离子脂质的细胞毒性和改善生物相容性，经过配方优化，所制备的脂质纳米颗粒具有粒径均一、分散可控、高稳定性、低免疫原性、低细胞毒性，在体内体外均具有较高的核酸递送效率等特点，制备工艺可控性强，是一种安全有效的核酸递送系统，具有潜在的临床应用价值。
[0008]本专利技术公开的甘草酸改性脂质纳米颗粒的制备方法包括以下三个内容：
[0009]内容1，制剂配方如下：(2，3
‑
二油酰基
‑
丙基)
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三甲基铵
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氯盐(DOTAP)、多烯磷脂酰胆碱(PPC)、胆固醇(Chol)、甘草酸(GA)，二硬脂酸磷酯酰乙醇胺
ꢀ‑
聚乙二醇聚合物(DSPE
‑
PEG2000)。其中，DOTAP，Chol，GA，PPC， DSPE
‑
PEG2000按照摩尔比1∶0.77∶X∶0.2∶0.03(X＝0.1
‑
0.6)混合。
[0010]内容2，制备工艺如下：将DOTAP，Chol，GA，PPC，DSPE
‑
PEG2000混合物溶解于有机溶剂中，配置成脂质混合物的有机溶剂溶液，将上述溶液经旋转蒸发器置于40
‑
45℃减压旋转蒸干，形成一层均匀的脂质薄膜。再向脂质薄膜中加入适量的水水化处理，经过超声均质使脂质在水中均匀分散并自组装成脂质纳米颗粒LNP。将上述所形成的LNP溶液经过脂质体挤出器挤出，使用 400nm、200nm的Whatman滤膜反复挤出11次使LNP均质并均匀分散，同时起到除菌过滤的作用，挤出后溶液收集于EP管中，即得到薄膜分散法制备的 LNP溶液。
[0011]内容3，脂质纳米颗粒包载核酸的方法如下：LNP包载RNA操作方法如下：将RNA溶液与与LNP溶液按照固定质量比进行室温混合，孵育10
‑
15min，即完成LNP包裹RNA的操作过程。经实验条件摸索，将LNP与RNA按照固定质量比进行孵育，可以达到较高的包封效率。
[0012]内容4，在本专利技术的实施方案中，其中，内容1中所述采用的改性材料为甘草酸。甘草酸的当量为0.1
‑
0.6，优选地，甘草酸的当量为0.4。
[0013]内容5，在本专利技术的实施方案中，其中，内容2中所述采用的溶解混合物的溶剂为乙醇、甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等，优选地，采用的溶解混合物的溶剂为乙醇。
[0014]内容6，在本专利技术的实施方案中，其中，内容3中所述脂质纳米颗粒包载核酸，其中核酸包括脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA，具体地，包括小干扰核酸(siRNA)、反义核苷酸(ASO)以及信使核糖核酸(mRNA)。
[0015]内容7，在本专利技术的实施方案中，其中，内容3中所述LNP与核酸按照固定质量比是控制DOTAP∶核酸＝10∶1
‑
20∶1(质量比)，具体地，当包裹小干扰核酸 (siRNA)、反义核苷酸(ASO)时，DOTAP∶siRNA＝19∶1(质量比)；当包裹mRNA 时，DOTAP∶mRNA＝15∶1(质量比)。
附图说明
[0016]图1：甘草酸改性脂质纳米颗粒的示意图以及透射电子显微镜(TEM)表征所制备甘草酸改性脂质纳米颗粒的形貌图。
[0017]图中Phospholipid Bilayer：脂质双分子层；Cholesterol：胆固醇；Glycyrrhizic acid：甘草酸；DSPE
‑
PEG2000：二硬脂酸磷酯酰乙醇胺
‑
聚乙二醇聚合物。siRNA：小干扰RNA。
[0018]图2：动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)表征所制备甘草酸改性脂质纳米颗粒的水合粒径和粒径分布。
[0019]图3：DLS表征所制备甘草酸改性脂质纳米颗粒的Zeta电位。
[0020]图4：流式细胞分析仪表征所制备甘草酸改性脂质纳米颗粒转染FAM标记siRNA 的转染效率。
[0021]图中FITC是绿色荧光的信号强度，SSC是明场信号强度。
[0022]图5：荧光显微镜表征所制备甘草酸改性脂质纳米颗粒转染Cy3标记ASO的转染效率。
[0023]图中标尺为200μm。
[0024]图6：荧光显微镜表征所制备甘草酸改性脂质纳米颗粒转染EGFPmRNA的转染效率。
[0025]图中标尺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明公开的甘草酸改性脂质纳米颗粒的制备方法包括以下三个内容：内容1，制剂配方如下：(2，3
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二油酰基
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丙基)
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三甲基铵
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氯盐(DOTAP)、多烯磷脂酰胆碱(PPC)、胆固醇(Chol)、甘草酸(GA)，二硬脂酸磷酯酰乙醇胺
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聚乙二醇聚合物(DSPE
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PEG2000)。其中，DOTAP，Chol，GA，PPC，DSPE
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PEG2000按照摩尔比1∶0.77∶X∶0.2∶0.03(X＝0.1
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0.6)混合。内容2，制备工艺如下：将DOTAP，Chol，GA，PPC，DSPE
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PEG2000混合物溶解于有机溶剂中，配置成脂质混合物的有机溶剂溶液，将上述溶液经旋转蒸发器置于40
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45℃减压旋转蒸干，形成一层均匀的脂质薄膜。再向脂质薄膜中加入适量的水水化处理，经过超声均质使脂质在水中均匀分散并自组装成脂质纳米颗粒LNP。将上述所形成的LNP溶液经过脂质体挤出器挤出，使用400nm、200nm的Whatman滤膜反复挤出11次使LNP均质并均匀分散，同时起到除菌过滤的作用，挤出后溶液收集于E...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，宋祥，阴启明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：