一种金属化脂质体制备方法、mRNA包封方法及其用途技术

一种金属化脂质体制备方法、mRNA包封方法及其用途，其中金属化脂质体制备方法包括如下步骤：步骤1、将脂质和金属阳离子充分混合形成金属化脂质体；步骤2、将得到的金属化脂质体制成若干冷冻干燥样。本发明专利技术将金属阳离子包封于脂质体内，形成金属化脂质体，使得脂质体的粒径分布更集中，可以避免脂质体融合；而后将制备成冷冻干燥样的金属化脂质体投入mRNA的包封，利用冷冻干燥样在重溶过程的虹吸作用和金属离子的电荷调控特性，快速包装mRNA，规避了常规脂质体在冻结和冷冻干燥过程中粒径容易变大且出现融合的情况，提升了脂质体在冷冻干燥和重熔之后的稳定性，提升包封率。将上述基于金属化脂质体包封后的mRNA颗粒用于细胞转染，可进一步提升转染效率。可进一步提升转染效率。可进一步提升转染效率。

【技术实现步骤摘要】
一种金属化脂质体制备方法、mRNA包封方法及其用途


[0001]本专利技术涉及生物制剂
，特别涉及一种金属化脂质体制备方法、mRNA包封方法及其用途。

技术介绍

[0002]信使RNA疗法(MRT)正在成为治疗各种疾病的越来越重要的方法。MRT涉及向需要治疗的患者施用信使RNA(mRNA)，以在患者体内产生由mRNA编码的蛋白质。实现更高的包封率和溶酶体逃逸效率、更精准的靶向递送和适度的免疫响应是筛选mRNA递送载体的主要目标。
[0003]现有技术中，一般采用微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒。这种方式单次制备所需mRNA为百μg量级(约2000元)。实际使用过程中，需要预先将mRNA包装到LNP内部，这对专业研究新型mRNA药物的科研机构极为不便。另外，单次制备的LNP量较大，保质期短且难以保存(2周左右)，往往造成药物浪费；由此导致mRNA脂质纳米颗粒使用成本过高，国内一般的科研院所或高校实验室难以有足够的财力和物力开展工作，使得国内在mRNA递送产品和相关专利方面发展受到极大限制。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中采用微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒的缺陷，从而提供一种金属化脂质体制备方法、mRNA包封方法及其用途。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种金属化脂质体制备方法，包括如下步骤：
[0007]步骤1、将脂质和金属阳离子充分混合形成金属化脂质体；
[0008]步骤2、将得到的金属化脂质体制成若干冷冻干燥样。
[0009]优选地，所述金属阳离子为Ca、Mg、Zn、Ba、Mn、Ni、Co中的任意一种或多种。
[0010]优选地，所述步骤1中：
[0011]采用薄膜分散法或超声波分散法或高压均质法制备金属化脂质体。
[0012]优选地，当采用薄膜分散法制备金属化脂质体时，包括如下步骤：
[0013]步骤1.1、选择阳离子脂质、辅助脂质和固醇溶于有机溶剂并置于容器中，对上述混合液真空旋蒸，直至在容器内壁上形成一薄膜；
[0014]步骤1.2、在容器加入金属阳离子水溶液，并混合，使得脂质薄膜完全分散到金属阳离子水溶液，形成金属化脂质体。
[0015]优选地，所述阳离子脂质为Dotap、L319、YSK12
‑
C4、CL4H6、SM
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102、ALC
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0315、Arcturus10q、ssPalmO
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Phe或DLin
‑
DMA
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MC3，所述辅助脂质为DSPE、DSPC、DOPE或DGTs，固醇包括胆固醇、β
‑
谷甾醇或生育酚，有机溶剂为乙醇、四氢呋喃、氯仿、甲醇或丙酮；
[0016]阳离子脂质体、辅助脂质和固醇的摩尔百分比为：阳离子脂质体在三者中的摩尔百分比为32％
‑
48％，辅助脂质在三者中的摩尔百分比为24％
‑
36％，固醇在三者中的摩尔
百分比为16％
‑
44％，有机溶剂的用量能够溶解上述材料。
[0017]优选地，所述步骤2还包括：
[0018]步骤2.1、使用脂质体挤出器挤出上述溶液，获得粒径均一化的金属化脂质体，金属化脂质体的粒径范围在100
‑
200nm；
[0019]步骤2.2、使用透析袋对金属化脂质体透析，除去多余的金属阳离子；
[0020]步骤2.3、将透析后的金属化脂质体溶液分成若干份，并在每份中加入蔗糖溶液，并使蔗糖溶液的最终质量范围为10％；
[0021]步骤2.4、按要求低温预冷冻设定时间，预冻结束后，进行真空低温干燥阶段，制备成冷冻干燥样。
[0022]优选地，所述步骤1.2中，采用超声波分散法的方式使脂质薄膜完全分散到金属阳离子水溶液；或者，采用均质分散法使脂质薄膜完全分散到金属阳离子水溶液。
[0023]为实现上述目的，本专利技术还采用了如下技术方案：
[0024]一种基于金属化脂质体的mRNA包封方法，包括如下步骤：
[0025]以PBS缓冲液为溶剂，配置mRNA溶液，加入上述方法制得的金属化脂质体的冷冻干燥样。
[0026]优选地，所述步骤还包括：
[0027]所述mRNA溶液中的mRNA与冷冻干燥样中的金属化脂质体的摩尔比为1：9至1：4.5。
[0028]为实现上述目的，本专利技术还采用了如下技术方案：
[0029]一种基于金属化脂质体包封的mRNA的用途，将按上述包封方法获得的mRNA用于细胞转染。
[0030]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0031]本专利技术将金属阳离子包封于脂质体内，形成金属化脂质体，使得脂质体的粒径分布更集中，可以避免脂质体融合；而后将制备成冷冻干燥样的金属化脂质体投入mRNA的包封，利用冷冻干燥样在重溶过程的虹吸作用和金属离子的电荷调控特性，快速包装mRNA，规避了常规脂质体在冻结和冷冻干燥过程中粒径容易变大且出现融合的情况，提升了脂质体在冷冻干燥和重熔之后的稳定性，提升包封率。将上述基于金属化脂质体包封后的mRNA颗粒用于细胞转染，可进一步提升转染效率。
[0032]本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分的从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其它优点可通过在所写的说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
[0033]下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0034]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。
[0035]在附图中：
[0036]图1是本专利技术实施例提供的金属化脂质体制备方法的示意图。
[0037]图2示出脂质体的粒径分布情况，包括市售的普通脂质体和本专利技术的多种金属化脂质体。
[0038]图3示出不同浓度的金属阳离子对Hela细胞的转染实验的结果。
[0039]图4为细胞转染效率图，包括不同用量下的实施例和对比例对HepG2细胞的转染效率。
[0040]图5为细胞转染效率图，包括不同用量下的实施例和对比例对LLC细胞的转染效率。
[0041]图6为细胞转染效率图，包括不同用量下的实施例和对比例对293T细胞的转染效率。
[0042]图7为细胞转染效率图，包括不同用量下的实施例和对比例对A549细胞的转染效率。
[0043]图8为细胞转染效率图，包括不同用量下的实施例和对比例对hela细胞的转染效率。
[0044]图9为细胞转染效率图，包括不同用量下的实施例和对比例对U251细胞的转染效率。
[0045]图10为细胞转染效率图，包括不同用量下的实施例和对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金属化脂质体制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1、将脂质和金属阳离子充分混合形成金属化脂质体；步骤2、将得到的金属化脂质体制成若干冷冻干燥样。2.如权利要求1所述的金属化脂质体制备方法，其特征在于：所述金属阳离子包括Ca、Mg、Zn、Ba、Mn、Ni、Co中的任意一种或多种。3.如权利要求1所述的金属化脂质体制备方法，其特征在于：所述步骤1中：采用薄膜分散法或超声波分散法或高压均质法制备金属化脂质体。4.如权利要求3所述的金属化脂质体制备方法，其特征在于，当采用薄膜分散法制备金属化脂质体时，包括如下步骤：步骤1.1、选择阳离子脂质、辅助脂质和固醇溶于有机溶剂并置于容器中，对上述混合液真空旋蒸，直至在容器内壁上形成一薄膜；步骤1.2、在容器加入金属阳离子水溶液，并混合，使得脂质薄膜完全分散到金属阳离子水溶液，形成金属化脂质体。5.如权利要求4所述的金属化脂质体制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质为Dotap、L319、YSK12
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C4、CL4H6、SM
‑
102、ALC
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0315、Arcturus10q、ssPalmO
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Phe或DLin
‑
DMA
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MC3，所述辅助脂质为DSPE、DSPC、DOPE或DGTs，固醇包括胆固醇、β
‑
谷甾醇或生育酚，有机溶剂为乙醇、四氢呋喃、氯仿、甲醇或丙酮；阳离子脂质体、辅助脂质和固醇的摩尔百分比为：阳离子脂质...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小龙，秦肇建，丁晓祎，姜泳卓，
申请(专利权)人：国科大杭州高等研究院，
类型：发明
国别省市：