一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法及应用技术

本发明专利技术涉及病毒标记技术领域，具体公开一种量子点标记技术示踪EV71(肠道病毒71)核酸的方法及应用，包括借助脂质体转染技术，采用CTAB标记的量子点对EV71

【技术实现步骤摘要】
一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法及应用


[0001]本专利技术涉及病毒标记
，具体涉及一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法。

技术介绍

[0002]儿童手足口病是全球流行性传染病，EV71是引发儿童重症手足口病的主要病原体，儿童感染其后如不及时治疗，很容易导致神经系统并发症的发生。近年来，有研究发现，EV71感染手足口病死者的脑组织标本中枢神经系统病变部位有EV71及淋巴细胞存在，这一现象在感染小鼠的动物模型中也得到了证实，说明EV71很可能具有嗜神经毒性。可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等，有些甚至死亡。而目前对EV71入侵宿主后如何致病的机制尚不是很明确，不利于抗EV71病毒靶向药物的设计及精准治疗的发展。
[0003]量子点是近年发展起来的新型荧光探针，其中水溶性的量子点在生物医学专利
有着非常广阔的应用前景，目前已有很多专利技术证实其具有优良的光谱特性、光稳定性等特点，更有利于对活细胞内核酸、蛋白分子的运动轨迹进行长时间实时监控，这使得实时揭示复杂生物过程中的分子个体及其运动步骤成为可能，但针对不同的病毒不同标记方法下，对细胞毒性、荧光显示时间、信号强度等影响不同。目前还未有报道量子点标记技术示踪EV71核酸的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是提供一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法，以帮助准确分析判断病毒的主要致病过程和作用机制，并为抗EV71病毒靶向药物的设计及精准治疗提供方向。
[0005]为实现以上目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0006]一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法，借助脂质体转染技术，将经量子点标记的EV71
‑
RNA转入细胞后，对标记后的EV71
‑
RNA进行活细胞动态成像检测。
[0007]进一步的，所述的细胞为神经皮质细胞，所述量子点为CTAB标记的量子点(CTAB
‑
Qdots)，所述脂质体转染用的试剂为Lipofectamine2000。
[0008]进一步的，确认EV71
‑
RNA与脂质体转染试剂Lipofectamine2000的最佳体积比为1:1。
[0009]优选的，CTAB量子点、脂质体转染试剂Lipofectamine2000以及EV71
‑
RNA三者的体积比为0.5:1:1。
[0010]本专利技术还提供了该方法在EV71病毒侵染活细胞后，监测EV71病毒核酸在活细胞内的定位、运动轨迹及生物学活性中的应用。
[0011]进一步的，应用方法为包括将经量子点标记好的病毒转染入细胞后，激光共聚焦显微镜检测发现EV71核酸导入后细胞内高表达内质网应激蛋白。
[0012]进一步的，所述应激蛋白为内质网应激标志蛋白GRP78。
[0013]进一步的，上述应用发现的应激蛋白可以作为治疗靶点，用于制备抗EV71病毒靶向药物。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0014](1)借助脂质体转染技术将EV71
‑
RNA和Lipo2000按1:1染入神经细胞后，细胞生长状态良好，脂质体对细胞毒性小，不影响细胞正常生长，且EV71
‑
RNA在细胞内稳定表达。
[0015](2)荧光显微镜下观察CTAB
‑
Qdots(量子点)标记EV71
‑
RNA后、转染神经细胞的荧光信号和细胞生长状态，确定CTAB量子点、Lipofectamine2000以及EV71
‑
RNA三者的最佳标记及转染比例为0.5:1:1。且以该比例处理的细胞在转染和标记后，荧光显微镜下观察到荧光信号强和细胞生长状态良好，细胞基本未发生凋亡，此剂量量子点的加入对细胞产生的毒性小。
[0016](3)将转染后的细胞置于激光共聚焦活细胞工作站下，可长时间、实时观察CTAB量子点标记的EV71
‑
RNA在神经细胞内的分布、定位、以及运动轨迹和生物学活性；
[0017](4)本专利技术主要从细胞水平入手，借助激光共聚焦显微镜对活细胞内的病毒核酸运动进行研究，可以直观地看到病毒在细胞内的运动轨迹。
附图说明
[0018]图1流式细胞术检测6h时对照组与实验组的细胞凋亡情况示意图。(N：Normal，正常细胞组；R：单独加EV71
‑
RNA细胞组；L：单独加Lipofectamine2000细胞组；Lipofectamine2000与EV71
‑
RNA分别以不同比例(1:1、1:2、1:3)混合加入细胞培养组。)
[0019]图2激光共聚焦检测分析脂质体转染EV71
‑
RNA的效率图。(h.p.t6h，hour posttransfection6hours，转染后6h；红色标记代表量子点标记的EV71
‑
RNA；图A为未处理正常细胞，图B、C、D中的细胞分别加入不同混合比例的EV71
‑
RNA与Lipofectamine2000进行培养。A：Normal，正常细胞相差显微图与荧光检测图的叠加图；A
′
：Normal，正常细胞的荧光检测图；B：实验组EV71
‑
RNA：Lipofectamine2000＝1:1的相差显微图与荧光检测图的叠加图，B
′
：B中细胞的荧光检测图；C：实验组EV71
‑
RNA：Lipofectamine2000＝1:2的相差显微图与荧光检测图的叠加图，C
′
：C中细胞的荧光检测图；D：实验组EV71
‑
RNA：Lipofectamine2000＝1:3的相差显微图与荧光检测图的叠加图，D
′
：D中细胞的荧光检测图。激光共聚焦检测分析在所观察的同一视野中，红色标记的已转染有EV71
‑
RNA的细胞数在所有细胞数中所占的百分率。Bar20μm。)
[0020]图3RT
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PCR检测及电泳条带确认EV71
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RNA与Lipo2000转染最佳比例效果示意图。(M：Marker；N：Normal，正常细胞组；R：单独加EV71
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RNA细胞组；L：单独加Lipofectamine2000细胞组；L+R(1:1、1:2、1:3)：Lipofectamine2000与EV71
‑
RNA分别以不同比例(1:1、1:2、1:3)混合加入细胞培养组；Actin为内参。)
[0021]图4荧光显微镜检测CTAB量子点标记的EV71
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RNA经脂质体转染入神经细胞后量子点荧光在细胞内的表达情况效果图。(h.p.t6h，hourposttransfection6hours，转染后6h；图A、B、C、D中的细胞分别加入了不同混合比例的CTAB量子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法，其特征在于，借助脂质体转染技术，将经量子点标记的EV71
‑
RNA转入细胞后，对标记后的EV71
‑
RNA进行活细胞动态成像检测。2.根据权利要求1所述的一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法，其特征在于，所述的细胞为神经皮质细胞，所述量子点为CTAB标记的量子点，所述脂质体转染用的试剂为Lipofectamine2000。3.根据权利要求2所述的一种量子点标记技术示踪EV71核酸的方法，其特征在于，EV71
‑
RNA与脂质体转染试剂Lipofectamine2000的体积比为1:1。4.根据权利要求3所述的一种量子点标记技术示踪EV71核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莉，刘晓宁，余佳，陶律延，贺晓丽，周远涛，张玉，王燕，
申请(专利权)人：昆明市儿童医院，
类型：发明
国别省市：