一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术设计DNA序列，通过体外转录出带有核仁素和功能蛋白的mRNA，使用脂质体包裹后制得脂质纳米粒，导入细胞表达核仁素和功能蛋白，核仁素作为一种反式作用因子结合RNA的3

【技术实现步骤摘要】
一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法。

技术介绍

[0002]核仁素是一种RNA结合蛋白，包含四个RNA结合区域，该区域提供特定的RNA结合位点,它们通过识别特殊的RNA结合域与核酸相互作用，广泛参与到RNA剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等多个过程。由于新冠疫情爆发，极大推动了mRNA技术在生物制药领域的应用，也让mRNA一跃成为研究的热点。mRNA疫苗比传统疫苗具有许多优势：与某些病毒疫苗不同，mRNA不会整合到基因组中，从而避免了插入突变的风险，mRNA疫苗可以以无细胞的方式制造，从而实现快速、经济、高效的生产。此外，单个mRNA疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。截止目前，全球累计mRNA药物及疫苗研发管线超过150种，主要针对传染病、肿瘤疾病、蛋白质替代与基因治疗。除mRNA新冠疫苗紧急上市外，其他大多处于早期阶段。研究表明，mRNA稳定性的调节在调节基因表达中起着重要作用，调节mRNA稳定性的许多元素位于mRNA的3
’
端非翻译区域即3
’
UTR，3'UTR位mRNA的C末端，UTR茎环结构中存在与mRNA结合蛋白的结合位点，调控mRNA稳定性、亚细胞定位并能与调节蛋白质相互作用，更好地发挥其调控功能。而如何获得在体内保持稳定的mRNA成为当前亟待研究的重要课题。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在着力解决现有mRNA在转录后易降解无法稳定表达蛋白的技术问题，本专利技术的目的是提供了一种利用核仁素增强mRNA稳定性表达的方法。
[0004]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0005]本方法通过DNA序列的设计，通过体外转录出带有核仁素和功能蛋白的mRNA，使用脂质体包裹后制得脂质纳米粒，导入细胞表达核仁素和功能蛋白，核仁素作为一种反式作用因子结合RNA的3
’
UTR，从而提高功能蛋白mRNA的稳定性，达到增强荧功能蛋白的表达量的效果。
[0006]一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法，主要包括如下步骤：
[0007](1)合成依次为T7启动子序列、5
’
UTR序列、优化后的核仁素序列、连接元件P2A序列、功能蛋白序列和3
’
UTR序列的目的基因序列，连接到质粒载体中，构建含有目的基因的质粒；
[0008](2)设计引物，将步骤(1)得到的质粒通过PCR反应获得目的基因尾部添加了polyT序列的线性目的基因片段；
[0009](3)以步骤(2)得到的线性目的基因片段为模板，转录获得mRNA；
[0010](4)通过加帽酶系统对步骤(3)得到的mRNA进行加帽反应，获得5
’
端携带cap1帽子结构的mRNA；
[0011](5)将步骤(4)得到的携带cap1帽子结构的mRNA和脂质体以特定比例混合，获得脂
质纳米粒；
[0012](6)将步骤(5)得到的脂质纳米粒转染细胞中，增强细胞中mRNA的稳定表达。
[0013]进一步地，步骤(1)中的所述质粒载体为PUC57
‑
Kan。
[0014]进一步地，步骤(1)中T7启动子序列如SEQ ID NO：1所示，5
’
UTR序列如SEQ ID NO：2所示，优化后的核仁素序列如SEQ ID NO：3所示，连接元件P2A序列如SEQ ID NO：4所示，功能蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，3
’
UTR序列如SEQ ID NO：6所示。
[0015]进一步地，步骤(2)中正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，PCR反应试剂包括BeyoFusion
TM
PCR Master Mix预混液。
[0016]进一步地，步骤(2)中PCR反应体系中质粒浓度为0.1
‑
10ng/μL。
[0017]进一步地，步骤(2)中所述线性目的基因片段通过磁珠纯化法获得。
[0018]进一步地，步骤(3)中所述转录的具体过程为：将线性目的基因片段、RNA转录酶、缓冲液、核苷三磷酸在室温下混合，于37℃条件下孵育3h。
[0019]进一步地，步骤(3)中转录完成后，加入DnaseⅠ，37℃孵育15min，以去除DNA模板。
[0020]进一步地，步骤(4)中所述的加帽酶系统为牛痘病毒加帽酶系统。
[0021]进一步地，步骤(5)中mRNA和脂质体的体积比为(1:1)～(1:5)，脂质体中阳离子脂质体、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇的摩尔比为50：10：37.5：2.5，所述阳离子脂质体为4
‑
(N,N
‑
二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯，辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱。
[0022]进一步地，步骤(6)中所述细胞为人宫颈癌细胞。
[0023]本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：
[0024]1.本专利技术所合成的mRNA均由体外进行转录进行加帽反应获得，细胞内存在许多RNA酶，它们可从5
’
端攻击游离的RNA，使mRNA极易降解，当mRNA的5
’
端加上m7GpppG帽子后，可阻止RNA酶的切割，延长mRNA的半衰期，提高翻译效率，同时真核生物mRNA必需通过5
’
帽结合蛋白才能接触核糖体从而正确起始翻译。
[0025]2.本方法在mRNA翻译过程中设计添加了核仁素，核仁素是一种RNA结合蛋白，在mRNA翻译的过程中作为反式作用因子，核仁素由四个结构域组成，其中核仁素的前两个RNA结合域顺式排列结合特定的核仁素识别原件，从而提高mRNA的稳定性，实现更加有效的翻译过程。
[0026]3.本实验编码区所采用的蛋白质序列均进行了优化，由于密码子使用偏好在不同物种甚至某一物种内的不同基因都具有特异性，同样的蛋白质可以从不同的基因序列中产生，有些组合会导致更高的蛋白质产量；对蛋白质的密码子进行优化，最佳密码子组合可以降低mRNA的降解，从而拥有高表达量的蛋白。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
[0028]图1为实施例1设计的DNA序列的结构图。
[0029]图2为实施例1中磁珠法纯化得到的高纯DNA的电泳图谱，第一孔道为marker，高亮条带为1k和3k，其余孔道均为PCR纯化后的上样条带。
[0030]图3为表达核仁素的mRNA和未表达核仁素的mRNA表达的荧光素酶量的对比图。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明，但本专利技术的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：(1)合成依次为T7启动子序列、5
’
UTR序列、优化后的核仁素序列、连接元件P2A序列、功能蛋白序列和3
’
UTR序列的目的基因序列，连接到质粒载体中，构建含有目的基因的质粒；(2)设计引物，将步骤(1)得到的质粒通过PCR反应获得目的基因尾部添加了polyT序列的线性目的基因片段；(3)以步骤(2)得到的线性目的基因片段为模板，转录获得mRNA；(4)通过加帽酶系统对步骤(3)得到的mRNA进行加帽反应，获得5
’
端携带cap1帽子结构的mRNA；(5)将步骤(4)得到的携带cap1帽子结构的mRNA和脂质体以特定比例混合，获得脂质纳米粒；(6)将步骤(5)得到的脂质纳米粒转染细胞，增强细胞中mRNA的稳定表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的所述质粒载体为PUC57
‑
Kan。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中T7启动子序列如SEQ ID NO：1所示，5
’
UTR序列如SEQ ID NO：2所示，优化后的核仁素序列如SEQ ID NO：3所示，连接元件P2A序列如SEQ ID NO：4所示，功能蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，3
’

【专利技术属性】
技术研发人员：林佳奇，马兴欢，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：