一种基于脂质体递送mRNA的免疫细胞培养及特异性负载激活方法技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，提供了一种基于脂质体递送mRNA的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，通过依次设计细胞因子DNA模板、合成基因构建于pIRES2

【技术实现步骤摘要】
一种基于脂质体递送mRNA的免疫细胞培养及特异性负载激活方法


[0001]本专利技术属于生物医学
，尤其涉及一种基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞培养方法，以及一种基于脂质体递送多元组合串联肿瘤抗原mRNA的免疫细胞特异性负载激活方法。
[0002]
技术介绍

[0003]人体的免疫细胞能够清除感染、凋亡、衰老、病变乃至癌变的异常细胞，守护着人体的健康。在肿瘤患者体内，和肿瘤细胞正面交锋的免疫细胞就数杀伤性T淋巴细胞。交锋的关键在于肿瘤基因突变被抗原呈递细胞识别为新抗原，新抗原成功激发肿瘤特异性的杀伤性CD8+T细胞。当机体免疫力正常，这一过程通常可以在发展到临床症状之前实现肿瘤细胞的免疫清除，但是因为免疫逃逸也会存在无法有效激活CD8
+
T细胞的情况。因此在体外培养免疫细胞，经过培养扩增、抗原激活、回输进行过继细胞治疗成为一种治疗肿瘤的有效手段。免疫细胞的培养扩增需要添加血清或细胞因子，例如培养T淋巴细胞时需要加入IL2和IL15细胞因子，培养巨噬细胞或树突细胞（DC cell）加入GM
‑
CSF和IL4细胞因子，并用肿瘤抗原进行特异性负载激活。但是当下血清和细胞因子的提取工艺复杂，成本高昂，且不利于实验的重复性、批次间生产的稳定性。特别是某些细胞因子的蛋白溶解性差或蛋白不稳定、需要翻译后修饰，生产工艺、提取工艺和保存工艺需要个性化摸索。
[0004]使用细胞因子的mRNA能够减少生产环节、省去复杂的差异化的蛋白生产提取工艺，更易于批量生产，更易于做质量控制，且成本更低、使用更方便。例如对于肿瘤浸润淋巴细胞的体外培养，需要高达6000IU/ml的细胞因子使用量，而使用微量的RNA即可以使得细胞持续产生细胞因子。但是RNA的一个致命缺点是容易降解，储藏条件较为苛刻。随着各种临床应用级脂质体的出现，使用按照一定比例配制的脂质体，可以将mRNA包裹在脂质体中受到保护，并能够有效递送到细胞释放有效成分，实现对免疫细胞进行体外高效培养激活扩增。
[0005]
技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种基于脂质体递送mRNA的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，旨在解决现有技术存在的问题。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞培养方法，包括以下步骤：S1、设计细胞因子DNA模板，合成基因构建于pIRES2
‑
EGFP载体，用于模板扩增和保存；S2、体外转录生产mRNA；
S3、配制脂质体，进行mRNA包装并生成脂质体颗粒；S4、将步骤S3获得的脂质体添加到免疫细胞；S5、进行基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞体外培养。
[0008]本专利技术还提供一种基于脂质体递送肿瘤抗原mRNA的免疫细胞特异性负载激活方法，包括：将多元组合串联肿瘤抗原负载免疫细胞或DC细胞，对免疫细胞进行肿瘤抗原靶向性激活；S1、设计多元组合串联肿瘤抗原DNA模板，合成基因构建于pIRES2
‑
EGFP载体，用于模板扩增和保存；S2、体外转录生产mRNA；S3、配制脂质体，进行mRNA包装并生成脂质体颗粒；S4、将步骤S3获得的脂质体添加到免疫细胞；S5、进行基于脂质体递送肿瘤抗原mRNA的免疫细胞特异性负载激活。
[0009]优选的，所述构设计细胞因子DNA模板，具体包括：对目标细胞因子进行全基因合成设计，合成序列包括T7启动子序列、通用5
’
UTR序列、细胞因子编码区ORF序列、通用5
’
UTR序列、100bp的聚合腺嘌呤序列：T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAGGG；通用5
’
UTR序列：AGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC；通用3
’
UTR序列：TAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC；Poly（A）序列：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
[0010]优选的，所述体外转录生产mRNA，具体包括：使用T7 RNA聚合酶体外转录生成mRNA，在转录体系中同时加入ARCA【3
′‑
O
‑
Me
‑
m7G(5
′
)ppp(5
′
)G】用于产生帽子结构；mRNA产物最终溶解在10mM柠檬酸盐/150mMNaCl中，PH值为4.5。
[0011]优选的，所述配制脂质体，进行mRNA包装并生成脂质体颗粒，具体包括：把脂质体原材料DOTAP（一种阳离子脂质）、DOPE（一种PE类助脂质）、胆固醇、PEG脂质溶解在乙醇中，根据摩尔比5：3.75：3.75：0.65进行混合；上述mRNA产物和脂质体混合物再以4：1的体积比，以脂质体快速注射到mRNA溶液的方式进行混合形成包埋目标mRNA的脂质体，mRNA终浓度0.2 mg/mL，无菌过滤后溶解在PBS溶液中待用。
[0012]优选的，将脂质体与60 mg/ml 的D
ꢀ‑
蔗糖混合进行冻干，然后在
−
80
ꢁ°
C条件下保存。
[0013]优选的，所述将步骤S3获得的脂质体添加到免疫细胞，具体包括：将分离的免疫细胞接种在细胞培养皿，加入RPMI1640培养基或X
‑
Vivo 15培养基；上述mNRA脂质体以每106细胞加入3
µ
g mRNA的比例加入培养基；对于肿瘤浸润淋
巴细胞，将IL2 mNRA脂质体以每106细胞加入3
µ
g mRNA的比例加入培养基，培养5天后更换一半培养基并加入1.5
µ
g mRNA，随后每2
‑
3天进行细胞传代培养，培养14
‑
21天后细胞数量达到10
10
级后收集细胞。
[0014]优选的，所述RPMI1640培养基或X
‑
Vivo 15培养基的成分包括10%人AB型血清、2
ꢁ
mmol谷氨酰胺、25
ꢁ
mMHEPES、10μg/mL庆大霉素。
[0015]优选的，所述进行基于脂质体递送肿瘤抗原mRNA的DC细胞培养，具体包括：在DC细胞的体外培养过程中，加入GM
‑
CSF/IL4细胞因子和TLR配体复合物刺激未分化的DC细胞；对未分化的DC细胞进行串联肿瘤抗原特异性负载，串联肿瘤抗原的基因合成序列如下：将信号肽片段（MRVTAPRTLILLLSGALALTETW本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、设计细胞因子DNA模板，合成基因构建于pIRES2
‑
EGFP载体，用于模板扩增和保存；S2、体外转录生产mRNA；S3、配制脂质体，进行mRNA包装并生成脂质体颗粒；S4、将步骤S3获得的脂质体添加到免疫细胞；S5、进行基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞体外培养。2.一种基于脂质体递送肿瘤抗原mRNA的免疫细胞特异性负载激活方法，其特征在于：将多元组合串联肿瘤抗原负载免疫细胞或DC细胞，对免疫细胞进行肿瘤抗原靶向性激活；包括以下步骤：S1、设计多元组合串联肿瘤抗原DNA模板，合成基因构建于pIRES2
‑
EGFP载体，用于模板扩增和保存；S2、体外转录生产mRNA；S3、配制脂质体，进行mRNA包装并生成脂质体颗粒；S4、将步骤S3获得的脂质体添加到免疫细胞；S5、进行基于脂质体递送肿瘤抗原mRNA的免疫细胞特异性负载激活。3.如权利要求1所述的一种基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞培养方法，其特征在于：所述设计细胞因子DNA模板，具体包括：对目标细胞因子进行全基因合成设计，合成序列包括T7启动子序列、通用5
’
UTR序列、细胞因子编码区ORF序列、通用5
’
UTR序列、100bp的聚合腺嘌呤序列：T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAGGG；通用5
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UTR序列：AGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC；通用3
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UTR序列：TAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC；Poly（A）序列：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。4.如权利要求1所述的一种基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞培养方法，其特征在于：所述体外转录生产mRNA，具体包括：使用T7 RNA聚合酶体外转录生成mRNA，在转录体系中同时加入ARCA【3
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O
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m7G(5
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)ppp(5
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)G】用于产生帽子结构；mRNA产物最终溶解在10mM柠檬酸盐/150mM NaCl中，PH值为4.5。5.如权利要求1所述的一种基于脂质体递送细胞因子mRNA的免疫细胞培养方法，其特征在于：所述配制脂质体，进行mRNA包装并生成脂质体颗粒，具体包括：把脂质体原材料DOTAP（一种阳离子脂质）、DOPE（一种PE类助脂质）、胆固醇、PE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张如奎，肖瑶，张秀英，刘兆瑞，
申请(专利权)人：苏州班凯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：