脂质纳米粒子制造技术

本发明专利技术的课题在于提供一种内含有基因组编辑所需的核酸等，能够通过使用流道而进行的醇稀释法制造，且基因组编辑效率优异的脂质纳米粒子。本发明专利技术为一种脂质纳米粒子，其含有脂质成分、DNA核酸酶、向导RNA、单链寡核苷酸，所述脂质成分含有pH敏感性阳离子型脂质、中性磷脂、聚亚烷基二醇修饰脂质，所述pH敏感性阳离子型脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为30摩尔％～50摩尔％，所述中性磷脂相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为20摩尔％～50摩尔％，所述聚亚烷基二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为1摩尔％～4摩尔％。摩尔％～4摩尔％。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脂质纳米粒子


[0001]本专利技术涉及一种脂质纳米粒子，该脂质纳米粒子能够用作用于通过CRISPR系统进行的基因组编辑的RNA
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蛋白质复合物(ribonucleoprotein，RNP)的载体。本申请基于2019年5月30日在日本提交的特愿2019
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101203号专利申请主张优先权，并将其内容引用在本申请中。

技术介绍

[0002]基因组编辑技术是可以向作为所需的任意的基因组DNA区域选择性地导入变异或插入包含基因的任意的DNA序列的生物技术。基因组编辑技术有望实现对于遗传性疾病、感染等各种顽固性疾病的根治，因此人们期待将基因组编辑技术应用于医药。其中，第三代基因组编辑技术CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR
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associated proteins 9)系统的基因敲除效率优异且设计简便，因此是目前最受关注的技术。本系统作为由具有DNA双链切断(double
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strand break；DSB)活性的Cas9蛋白和嵌合RNA即gRNA组成的RNP而起作用，其中，该嵌合RNA即gRNA由来自细菌的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans
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activating CRISPRRNA)构成。因此，通过在靶细胞内表达RNP或将RNP本身输送至靶细胞内，可以诱导所需的基因敲除。并且，通过同时输送供体DNA，还可以诱导基因敲入。
[0003]作为基因组编辑技术中向靶细胞内输送的手段，具有：通过导入DNA或RNA而在细胞内表达RNP的方法、将RNP本身直接导入细胞的方法。在前者的情况下，已经在一定程度上建立了病毒载体、非病毒载体等的输送技术，因此能够较容易地进行，但Cas9蛋白的表达跨时较长，因此容易发生向不期待的DNA区域内导入变异(脱靶效应)。另一方面，在后者的情况下，在靶DNA区域中导入变异之后，RNP快速分解、消失，因此，能够将脱靶效应抑制为最小程度。特别是在伴随DSB的基因组编辑中，只要编辑后的细胞存活，则影响将一直持续，因此对于脱靶效应的抑制至关重要。
[0004]已经报道有多种能够输送RNP本身的技术的开发。例如有：使用DNA纳米线团(DNA Nanoclews)的方法(非专利文献1)、使用体内还原性脂质纳米粒子的方法(非专利文献2)、使用与金纳米粒子的偶联物的方法(非专利文献3)、使用类脂质(lipidoid)的方法(非专利文献4)、使用卵磷脂纳米脂质颗粒(lecithin nano
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liposomal particle)的方法(非专利文献5)。另外，作为诱导基因敲入的例子，报道有CRISPR
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Gold(非专利文献6)。但是，这些方法都在基因组编辑效率方面存在待解决课题，例如为了在培养细胞中诱导基因敲减，均需要高浓度的Cas9等。
[0005]另一方面，作为内含核酸等的脂质纳米粒子的制造方法，有以使用流道的醇稀释法为原理的方法。例如，报道有：通过使用可以实现两种液体瞬间混合的内置三维微型混合器的微型流道，可以重现性良好地制造直径30nm左右的脂质纳米粒子(非专利文献7)。另外，还报道有：通过使用单纯的二维结构的流道结构体，与现有的使用三维混合器的流道结构体相比，能够形成粒径可控性更高的纳米尺寸的脂质粒子形成系统(专利文献1)，所述单
纯的二维结构的流道结构体在流通原料溶液的微型尺寸的流道上，从两侧面交错配置有相对于流道宽度为一定宽度的挡板(扰流板)。近年来，这些纳米粒子制剂的制造方法主要用于制造负载有脂溶性药物、siRNA(short interfering RNA)或mRNA等核酸的脂质纳米粒子(LNP)。例如，就作为用于向靶细胞内高效地输送siRNA等核酸的载体的脂质纳米粒子而言，报道有包含pH敏感性阳离子型脂质作为构成脂质的脂质纳米粒子(专利文献2)。现有技术文献专利文献
[0006]专利文献1：国际公开第2018/190423号专利文献2：国际公开第2018/230710号非专利文献
[0007]非专利文献1：Sun et al.,Angewandte Chemie International Edition,2015,vol.54,p.12029
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12033.非专利文献2：Wang et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2016,vol.113,p.2868
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2873.非专利文献3：Mout et al.,American Chemical Society Nano,2017,vol.11,p.2452
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2458.非专利文献4：Li et al.,Biomaterials,2018,vol.178,p.652
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662.非专利文献5：Cho et al.,Journal of Nanobiotechnology,2019,vol.17,p.19.非专利文献6：Lee et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,vol.1,p.889
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901.非专利文献7：Leung et al.,Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces，2012，vol.116(34),p.18440
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18450.非专利文献8：Stroock et al.,Science,2002,vol.295,p.647
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技术实现思路

专利技术所要解决的技术课题
[0008]与一直以来使用的低分子药物、核酸相比，RNP等蛋白质更容易因醇等有机溶剂、缓冲液的pH、盐浓度、温度等粒子制造时的各种物理参数而受到不可逆灭活。因而，现今为止尚未有以醇稀释法为原理的负载有RNP的脂质纳米粒子制剂的制造的相关报告。
[0009]本专利技术的目的在于提供一种脂质纳米粒子，其内含有基因组编辑所需的核酸等，可以通过使用流道的醇稀释法来制造，且基因组编辑效率优异。
[0010]本专利技术的专利技术人发现，在利用CRISPR/Cas9系统进行的基因组编辑中，通过将crRNA、tracrRNA、及Cas9蛋白的复合物RNP进一步和包含与crRNA互补的碱基序列区域的单链寡核苷酸(ssON)形成复合物并使其帯负电，能够高效地负载于由包含pH敏感性阳离子型脂质的特定组成的脂质膜结构构成的脂质纳米粒子，从而完成了本专利技术。
[0011]即，本专利技术提供以下的脂质纳米粒子。(1)一种脂质纳米粒子，所述脂质纳米粒子含有脂质成分、DNA核酸酶、向导RNA、单链寡核苷酸，所述脂质成分含有下述通式(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种脂质纳米粒子，所述脂质纳米粒子含有脂质成分、DNA核酸酶、向导RNA、单链寡核苷酸，所述脂质成分含有下述通式(I)表示的pH敏感性阳离子型脂质、中性磷脂、聚亚烷基二醇修饰脂质，[化学式1](R1)(R2)C(OH)
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(CH2)a
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(O
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CO)b
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X
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(I)式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1；R1和R2分别独立地表示下述通式(A)表示的基团，[化学式2]CH3‑
(CH2)q
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(CH＝CH)r
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(CH2)s
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(CH＝CH)t
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(CH2)u
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(CO
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O)c
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(CH2)v
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(A)式(A)中，q表示1～9的整数；r表示0或1；s表示1～3的整数；t表示0或1；u表示1～8的整数；c表示0或1；v表示4～12的整数；q+2r+s+2t+u+c+v为19以上的整数，但在b和c同时为0的情况下，则如下情况除外：q为3～5的整数，r及t为1，s为1，且u+v为6～10的整数；X表示下述通式(B)表示的基团或5～7元非芳香族杂环基，其中，该基团通过碳原子键合于(O
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CO)b
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，该环的1个或2个氢原子可以被C1‑4烷基或C2‑4烯基取代，[化学式3]
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(CH2)d
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N(R3)(R4)
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(B)式(B)中，d表示0～3的整数；R3和R4分别独立地表示C1‑4烷基或C2‑4烯基，其中，该C1‑4烷基或C2‑4烯基的1个或2个氢原子可以被苯基取代，但R3和R4也可以彼此键合而形成5～7元非芳香族杂环，其中，该环的1个或2个氢原子可以被C1‑4烷基或C2‑4烯基取代，所述pH敏感性阳离子型脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为30摩尔％～50摩尔％，所述中性磷脂相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为20摩尔％～50摩尔％，所述聚亚烷基二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为1摩尔％～4摩尔％。2.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中，所述中性磷脂为具有碳原子数12～24的饱和或不饱...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤悠介，原岛秀吉，渡庆次学，真荣城正寿，
申请(专利权)人：国立大学法人北海道大学，
类型：发明
国别省市：