聚乙烯亚胺-脱氧核糖核酸复合物大小和活性的稳定化制造技术

公开了用于生产预定大小的聚合物

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】聚乙烯亚胺
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脱氧核糖核酸复合物大小和活性的稳定化
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年4月27日提交的美国临时申请号63/016,166的在先申请日的优先权权益，并且要求2020年5月11日提交的美国临时申请号63/023,119的在先申请日的优先权权益，这两个申请中的每一个通过引用以其整体并入于此。


[0002]本公开文本总体上涉及病毒载体过程开发的领域，并且特别地涉及诸如通过使聚乙烯亚胺(PEI)
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脱氧核糖核酸(DNA)复合物活性和大小稳定来改进病毒载体滴度、产量和/或产率的方法。

技术介绍

[0003]多种基因疗法方法可用于治疗疾病和病症。慢病毒载体(LVV)和腺相关病毒载体(AAV)在许多基因疗法过程中起关键作用。许多商业化的LVV生产和/或AAV过程利用粘附细胞培养物进行生产。虽然这些过程已经能够满足商业需求，但是它们需要横向扩展以增加批量大小，这限制了最大过程规模。粘附过程还经常需要添加动物产品(如胎牛血清)以维持细胞健康。使用动物来源的血清可能增加外来试剂(包括病毒)的可能污染，并显著增加商业化成本。因此，对粘附细胞培养物的依赖会使用于临床试验的动态药品生产管理规范(cGMP)级LVV和/或AAV的制造复杂化，并且此类问题会进一步加重商业化努力。需要用于制造和/或工程化此类基因疗法的改进方法，包括开发无血清悬浮过程以提供更有效和更有效力的病毒载体生产方法。

技术实现思路

[0004]本文公开了用于提供具有所需流体动力学直径的聚合物
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DNA转染复合物、用于改进转染效率和下游基因表达、特别是关于编码病毒颗粒(例如，慢病毒载体和/或腺相关病毒载体)的基因的表达的方法和系统。所提供的方法和系统改进了纵向扩展用于多种应用的病毒载体生产的能力，所述应用包括但不限于基因疗法和/或细胞疗法。
[0005]在一个方面，所公开的方法包括将第一预定量的第一浓度的PEI溶液添加到第二预定量的第二浓度的DNA溶液中并且混合以获得在溶液中的PEI
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DNA复合物，在第一预定持续时间之后，将第三预定量的PEI
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DNA转染复合物稳定剂添加到所述PEI
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DNA溶液中以获得稳定的PEI
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DNA复合物，以及在所述第一预定持续时间后的第二预定持续时间之后，用所述稳定的PEI
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DNA复合物转染细胞群。
[0006]在一个实施方案中，所述方法包括其中所述第一预定持续时间是所述第一浓度和所述第二浓度的函数。在一些实施方案中，所述第一预定持续时间随着所述第一浓度和所述第二浓度的降低而增加，并且其中所述第一预定持续时间随着所述第一浓度和所述第二浓度的增加而降低。
[0007]在一个实施方案中，所述第一预定保持时间是PEI
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DNA复合物的所需大小的函数。
在一些例子中，所需大小是直径在400纳米与1000纳米之间。在例子中，所述第一预定保持时间是在30秒与15分钟之间。例如，所述第一预定保持时间可以是30秒、在30秒与1分钟之间、在1
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2分钟之间、在2
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3分钟之间、在3
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4分钟之间、在4
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5分钟之间、在5
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6分钟之间、在6
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7分钟之间、在7
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8分钟之间、在8
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9分钟之间、在9
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10分钟之间、在10
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11分钟之间、在11
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12分钟之间、在12
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13分钟之间、在13
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14分钟之间或在14
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15分钟之间。在具体例子中，所述第一预定保持时间是30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟或15分钟。
[0008]在一个实施方案中，所述DNA溶液进一步包含一种或多种DNA质粒。作为例子，所述一种或多种DNA质粒进一步包含转移质粒，所述转移质粒包含用于合成一种或多种病毒蛋白的一种或多种基因。在一些例子中，所述一种或多种基因包括慢病毒基因组的至少一部分的基因。在另外的或替代的例子中，所述一种或多种基因包括腺相关病毒基因组的至少一部分的基因。
[0009]在一个实施方案中，所述细胞群进一步包含哺乳动物细胞。例如，所述细胞群进一步包含人胚肾(HEK)293悬浮细胞。在其他例子中，哺乳动物细胞群可以包括但不限于HeLa、U2OS、A549、HT1080、CAD、P19、NIH 3T3、L929、N2a、重组中国仓鼠卵巢(CHO)、MCF
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7、Y79、SO
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Rb50、Hep G2、DUKX
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X11、J558L和/或幼仓鼠肾(BHK)细胞。
[0010]在一个实施方案中，所述稳定的PEI
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DNA复合物在转染所述细胞群之前不冷冻。
[0011]在一个实施方案中，所述第二预定持续时间是在将所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂添加到所述PEI
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DNA溶液之后的一分钟与十八小时之间。
[0012]在一个实施方案中，所述第二预定持续时间大于五分钟且小于两小时。
[0013]在一个实施方案中，所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂是非重组人血清白蛋白(HSA)。
[0014]在一个实施方案中，所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂是从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)纯化的重组白蛋白。
[0015]在一个实施方案中，所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂是重组人血清白蛋白(HSA)。
[0016]还提供了一种用于使多聚复合物(polyplex)的大小稳定的方法，所述方法包括将包含脱氧核糖核酸(DNA)的第一溶液与包含阳离子聚合物的第二溶液混合在一起以获得多聚复合物溶液，以及在将所述第一溶液和所述第二溶液混合在一起后的预定时间，将多聚复合物稳定剂添加到所述多聚复合物溶液中以使所述多聚复合物的大小稳定。
[0017]在一个实施方案中，所述预定时间是基于所述多聚复合物的所需大小选择的，并且所述所需大小是直径在400纳米与1000纳米之间。
[0018]在一个实施方案中，所述多聚复合物的大小随着所述预定时间的增加而增加，并且随着所述预定时间的减少而减少。
[0019]在一个实施方案中，使所述多聚复合物的大小稳定是通过添加所述多聚复合物稳定剂来防止所述多聚复合物的大小继续增加来实现的。
[0020]在一个实施方案中，所述多聚复合物稳定剂是非重组人血清白蛋白(HSA)。
[0021]在一个实施方案中，所述多聚复合物稳定剂是从巴斯德本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，所述方法包括：将第一预定量的第一浓度的PEI溶液添加到第二预定量的第二浓度的DNA溶液中并且混合以获得在溶液中的PEI
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DNA复合物；在第一预定持续时间之后，将第三预定量的PEI
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DNA转染复合物稳定剂添加到所述PEI
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DNA溶液中以获得稳定的PEI
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DNA复合物；以及在所述第一预定持续时间后的第二预定持续时间之后，用所述稳定的PEI
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DNA复合物转染细胞群。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一预定持续时间是所述第一浓度和所述第二浓度的函数。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一预定持续时间随着所述第一浓度和所述第二浓度的降低而增加；并且其中所述第一预定持续时间随着所述第一浓度和所述第二浓度的增加而降低。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一预定保持时间是所述PEI
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DNA复合物的所需大小的函数。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述所需大小是直径在400纳米与1000纳米之间。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA溶液进一步包含一种或多种DNA质粒。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种DNA质粒进一步包含转移质粒，所述转移质粒包含用于合成一种或多种病毒蛋白的一种或多种基因。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种基因包括用于慢病毒基因组或腺相关病毒基因组的至少一部分的基因。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞群包含哺乳动物细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人胚肾(HEK)293悬浮细胞。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述稳定的PEI
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DNA复合物在转染所述细胞群之前不冷冻。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二预定持续时间是在将所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂添加到所述PEI
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DNA溶液之后的一分钟与十八小时之间。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二预定持续时间大于五分钟且小于两小时。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂是非重组人血清白蛋白(HSA)。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂是从巴斯德毕赤酵母纯化的重组白蛋白。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述PEI
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DNA转染复合物稳定剂是重组人血清白蛋白(HSA)。17.一种用于使多聚复合物的大小稳定的方法，所述方法包括：将包含脱氧核糖核酸(DNA)的第一溶液与包含阳离子聚合物的第二溶液混合在一起以获得多聚复合物溶液；以及在将所述第一溶液和所述第二溶液混合在一起后的预定时间，将多聚复合物稳定剂添加到所述多聚复合物溶液中以使所述多聚复合物的大小稳定。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述预定时间是基于所述多聚复合物的所需大小选择的；并且其中所述所需大小是直径在400纳米与1000纳米之间。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述多聚复合物的大小随着所述预定时间的增加而增加，并且随着所述预定时间的减少而减少。20.根据权利要求17所述的方法，其中通过添加所述多聚复合物稳定剂使所述多聚复合物的大小稳定，从而防止...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：朱诺治疗学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：